一、名词解释1.代换系：是指受体材料的染色体被外源染色体取代后形成的个体。

2.基因工程：是根据预先设计要求，借助实验室技术，将某种生物的基因转移到另一个体中，使后者定向获得新的遗传性状或者生产某种产品。

3.遗传标记：是指可遗传的、特定的、易于识别的生物体特性。

4.细胞全能性：是指生物体的每个细胞都具有该物种的全部遗传信息，离体细胞在一定的培养条件下具有发育成完整个体的能力。

5.不对称杂交：在原生质体融合前，利用X 射线等处理其中的一个亲本，使其核基因组失活，然后用这种失活的原生质体与正常或者经过化学处理的原生质体进行融合。

这种原生体融合方式叫不对称杂交。

6.异附加系：是指添加了外源染色体的个体。

7.遗传工程：是根据预先设计要求，借助实验技术，将某种生物的基因或者基因组转移到另一个体中，使后者定向获得新的遗传性状或者生产某种产品。

8.细胞学标记：是指某个体或者物种特有的染色体数目、核型、带型特性。

9.外植体：是指从特定生物体上切取下来、用于组织培养的离体材料。

10.不对称杂种：在不对称杂交交时，供体原生质体只给受体原生质体提供其基因组中的少量染色体或染色体片段，并与受体原生质体的完整基因组染色体共存。

这种不对称杂交所产生的融合细胞，叫不对称杂种。

11.共抑制：当受体被导入一个与受体内某基因同源的基因时，导入的基因及受体中与外源同源的基因的表达都可能减弱的现象。

12.遗传累赘：当一条载有目的基因的外源染色体导入受体后，受体往往表现出供体亲本的某些不良特性的现象。

13. 愈伤组织：是指在培养或自然条件下植物细胞经脱分化不断增值形成的由薄壁细胞组成的不定组织。

14.染色体组：维持某一物种生命活动所需的最低数目的一套染色体，也是该物种发生数目变异时所所需的最低数的一套染色体。

15.原生质体：是指去掉纤维素外壁的具有生活力的裸露细胞。

二、简答题1. 请你说明互补选择(杂种体细胞选择方法)的原理。

互补选择法是利用天然或者人工诱发的营养缺陷型及抗性突变细胞对异核体进行选择。

以烟草双突变体杂种体细胞选择为例，该双突变体（硝酸还原酶缺陷突变、链霉素抗性突变）在含有还原态氮和链霉素的培养基上能正常生长。

如果利用这个双突变体的原生质体与另一无选择性标记的亲本原生质体融合，融合产物置于加有链霉素、但不加还原态氮的培养基上。

双突变体的同核体由于缺乏硝酸还原酶不能正常生长；另一亲本的同核体由于不抗链霉素，也不能生长；只有同时含有双方遗传物质的异核体才能正常生长，从而可达到筛选异核体的目的。

2. 请你用一简单的示图说明分子标记辅助选择的原理。

3. 请你简要说明，目前基因工程所面临的主要问题。

b. 由于插入位点不适合或者共抑制等原因，目的基因在受体中的，特别是小麦等多倍体五种中的表达能力下降，甚至失去表达能力；c. 目前安全选择标记和无标记转化技术的应用还有限，转基因安全性仍然不能忽视；d. 目的基因随机整合到受体中，一方面可能引起目的基因表达下降，另一方面也可能导致受体本身的基因发生突变。

4. 请你说明α-互补筛选(筛选阳性克隆)的原理。

a.当载体与目标基因重组时，可能获得载体与目标基因的重组分子或者没有发生重组的空载体。

b.利用载体与目标基因重组反应产物转化宿主细胞，主要会出现三种情况，即重组分子进入宿主、空载体进入宿主、没有获得重组分子和空载体分子的宿主细胞。

c.在载体中连接上β-半乳糖苷酶基因的调控序列、N-端146个氨基酸的编码序列和选择性标记基因（如：氨苄青霉素抗性基因）。

转化宿主细胞为含有β-半乳糖苷酶基因C端序列的宿主细胞，将转化细胞反应液至于含有IPTG/X-gal和氨苄青霉素的培养基上培养。

d.没有获得重组分子和空载体分子的宿主细胞不能在该培养基上生长；含有空载体的宿主细胞可通过载体产生β-半乳糖苷酶的N-端序列，也可通过宿主细胞产生β-半乳糖苷酶的C-端序列。

这两种β-半乳糖苷酶序列可互补，形成有活性的β-半乳糖苷酶，从而降解培养基中的IPTG/X-gal，使菌落呈蓝色。

当外源基因插入到β-半乳糖苷酶基因的调控序列、N-端146个氨基酸的编码序列之间（构建载体时，在此设计了多克隆位点）时，破坏此酶N-端的阅读框，从而不能行有活性的β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。

5. 请你简单说明分子标记辅助选择的基本条件。

a．分子标记与目标基因共分离或者紧密连锁（遗传距离＜5厘摩尔根)；b. 具有快捷、简单的DNA自动化提取和检测方法，检测标记最好是PCR标记；c. 检测技术具有较高的重复性、经济适用；d. 有一套能准确进行数据分析的计算机软件。

6. 请你说明常用的基因工程载体必须具备那些条件？a．选择性标记，如四环素抗性基因等b.多克隆位点；c.易于回收；d.在宿主细胞中能自我复制，稳定遗传保存。

7. 请你简要说明分子标记的主要共同特点.a.直接以DNA的形式表现，不受生物体的组织、器官、发育时期的限制，不受季节、环境条件的限制，不存在是否表达的问题；b.数量多，遍及整个基因组，检测为点近乎无限；c.多态性高，自然存在许多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料；d.表现“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的联系；e.有许多分子标记表现为共线性，能够辨别纯合基因型和杂合基因型，可提供完整的遗传信息。

8.请你简要说明DNA电击转化的基本原理。

在电击后，细胞膜上形成一些可逆的微孔，这些微孔直径约30nm，一般需要几分钟才能恢复，DNA、RNA或其它大分子物质可以通过细胞膜上的这些微孔进入细胞。

在电击过程中，如果细胞核刚好位于电极区域，则DNA还可以穿过核膜进入细胞核，从而躲过细胞质中的核酸酶的作用、并通过DNA重组插入受体基因组中形成转化体。

9.请你举例说明融合细胞的生长差异选择原理。

利用亲本双方原生质体在特殊培养条件下生长能力的差异设计一种只能使杂种细胞生长的培养基。

如拟矮牵牛原生质体在MS培养基上能分裂成小细胞团，但不能进一步形成愈伤组织，其生长不受1mg/L的放线菌素-D的抑制；矮牵牛原生质体在MS培养基上能分裂形成愈伤，当在上述浓度的放线菌素-D的培养基上不能分裂。

将两者融合的产物培养在MS加1mg/L的放线菌素-D的培养基上，结果只有同时具有双亲基因组的杂种细胞才能长成愈伤组织并分化发育成植株。

10. 请你简要说明RFLP标记的主要原理。

特定生物类型的基因组DNA经限制性内切酶消化后，产生数万条DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳将这些片段按大小顺序分离开来。

然后将它们按原来的顺序和位置转移到易于操作的尼龙膜或醋酸纤维膜上。

用同位素或非放射性物质标记的DNA作为探针，与膜上的DNA分子杂交。

若某一位置上的DNA酶切片段与探针相似，或者说同源程度较高，则标记号的探针就结合于这个位置上。

经放射性自显影或酶学检测，即可显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。

三、实验设计题1.某人获得了小麦的特定单体和二体附加系，并希望利用这些材料培育异代换系。

请根据他具有的材料，设计一个培育异代换系的实验方案（可用示图表示）。

2. 请你设计一个鉴定小麦白粉病抗性候选基因重组体的实验方案（可用示图表示）。

a.将该候选基因连接到质粒载体pUC19 的多克隆位点，形成重组分子；b.以含有β-半乳糖苷酶基因C端序列的大肠杆菌细胞为宿主细胞，利用重组产物转化宿主细胞。

c.将转化产物置于含有IPTG/X-gal和氨苄青霉素的培养基上培养。

d.经过一段时间的培养，从中挑选白色菌落，根据a-互补选择的原理，白色菌落为含有目的基因的阳性克隆。

3. 请你设计一个培育小麦—簇毛麦异附加系的实验方案（可用示图表示）。

4.请你设计一个筛选杂种体细胞的实验体系。

利用在特定培养基上生长分化能力有差异的两种原生质体，如拟矮牵牛原生质体和矮牵牛原生质体，前者在MS 培养基上能分裂成小细胞团、不受放线菌素-D抑制、但不能进一步形成愈伤组织，后者在MS 培养基能形成愈伤组织，但受放线菌素-D抑制。

当这两种原生质体融合时，可设计如下实验体系筛选杂种体细胞：将两者的融合产物培养在加1mg/L 的放线菌素-D的MS 培养基上，结果只有具备双亲基因组的杂种细胞才能长成愈伤组织并分化发育成植株，从而达到筛选杂种体细胞的目的。

5.请你设计一个以小麦幼胚为材料、诱导愈伤组织的实验方案。

选择适宜土地种植、并精心管理实验材料。

取开花后10-12天幼穗，剥出幼嫩种子、置于干净的培养皿中。

在4℃低温预处理48小时。

之后，在无菌操作台上，用9%-10%的次录酸钙消毒30分钟，然后用无菌水清洗3次。

利用解剖刀小心剥出幼胚，置于已配好的加入10mg/L IAA（吲哚乙酸）的MS培养基上，幼胚正面朝上。

利用玻璃纸密封盛有培养基和幼胚的培养皿，将培养皿置于25℃、2000Lx光照、以12小时为光暗交替培养条件，恒温培养直，至长出幼苗或所需的愈伤组织。

6.请你设计一个分离和纯化水稻原生质体的实验方案。

在10cm培养皿中加入10-15mL原生质体分离酶液和大约1-1.5g除去培养液的悬浮细胞。

石蜡封口。

在25℃暗培养条件下，以20r/min振摇4h。

在一个漏斗中放上孔径为30µm的滤网，让保温后的分离酶液通过滤网收集到离心管中。

以600r/min离心5min，去除上清液，将沉淀用原生质体洗液CPW 6M洗涤2次，每次用600r/min 离心3min，去除上清液。

用1-2mLCPW 6M重新悬浮原生质体。

用吸管在离心管底部缓慢注入0.6mol/L的蔗糖溶液5mL。

以500r/min离心10min。

原生质体漂浮在蔗糖溶液和CPW 6M液的界面之间。

用吸管收集原生质体，加5mL CPW 6M液稀释。

600r/min离心3min，去除上清液。

加入PEG反应基液，使原生质体密度为2x105个/mL。

按10µg/mL质粒DNA和50µg/mL小牛胸腺DNA 的浓度加入DNA。

加入DNA之前可以将原生质体置45℃水浴中热击5min，再在水浴中迅速冷却。

逐步加入1/2体积的40%的PEC，每次加入后温和摇匀。

6000分步加入5倍体积的CPW 6M，每次间隔1-2min。

以600r/min离心5min，去除上清液。

用CPW 6M 重新悬浮原生质体，计数，去除上清液，准备培养。

四、填空题1.目的基因、工具酶、载体、宿主细胞2.5.5-5.8、250C、123.平末端、粘性末端4.125.形态标记、细胞学标记、生化标记6.染色体组操作、单条染色体操作、染色体片段操作7.果胶酶、纤维素酶8. 叶片、愈伤组织9.基因转化、农杆菌介导转化、电击转化、PEG介导转化10.致癌区、毒性区、致癌区、毒性区11.SSR、STS、EST12.42。