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3.流动相及流动相的极性 ①可显著改变组分分离状况的流动相选
择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：
淋洗液，洗脱剂。 ②亲水性固定液常采用疏水性流动相，
即流动相的极性小于固定相的极性， 称为正相液液色谱法， 极性柱也称正相柱。
——适合极性化合物分离。
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③若流动相的极性大于固定液的极性，则称为 反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。 ——适合非极性化合物分离。
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②光电二极管阵列检测器（DAD） 为新型的紫外吸收检测器。以氘灯为光源，绘制出 随时间变化的光谱吸收曲线（A～λ）计算机快速处 理，可获得分离组分的三维彩色谱图，得到更多信 息。
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③示差折光率检测器（RID）—通用型。
每种物质具有不同的折光指数，可连续检测参比池 和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓 度呈正比。灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度 洗脱。
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高压输液泵的种类： ①恒压泵—液压隔膜泵和气动放大泵。 ②恒流泵—螺旋注射泵和往返柱塞泵。
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（2）梯度淋洗装置 HPLC有等梯度洗脱和梯度洗脱两种。
前者保持流动相组成、配比恒定。 后者采用两种或多种不同极性的溶剂，在分离
过程中按照程序连续改变流动相的浓度配比 及极性。 梯度淋洗的作用： 提高分离度
通过组分在固定液和固定相中的多次分配平衡 进行分离。
分为正相色谱和反相色谱。 正相色谱：极性固定相、弱极性或非极性流
动相 — 分离中等极性化合物。 反相色谱：非极性固定相、以水为底剂加入
少量有机溶剂的极性流动相 — 分离极性小的样品。
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3.化学键合相色谱（CBPC ）
用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体 表面。 反相CBPC：非极性固定相、极性流动相。
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5.凝胶色谱（空间排阻色谱）SEC （1）以凝胶为固定相。 （2）凝胶是一种经过交联的、具有立体网
状结构和不同孔径的多聚体的通称。 如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶； 多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。 （3）利用凝胶的孔径与被分离组分分子间 的相对大小关系进行分离、分析，与 流动相性质无关。
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HPLC—梯度淋洗改变的是流动相的配比和极， 提高分离效果，缩短分离时间，改善峰形。 通过改变流动相的配比和流速是HPLC中 改进分离效果重要手段。
GC — 程序升温，改变的是分析过程中的柱温。
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(3)进样装置 分为手动进样（进样器进样和阀进样）和自
动进样（自动进样器进样）两种。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压
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④荧光检测器 （FD） —选择性检测器 高灵敏度、高选 择性； 对多环芳 烃，维生素B、黄 曲霉素、卟啉类 化合物、农药、 药物、氨基酸等 化合物有响应。
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17-3 高效液相色谱法的类型
一、影响液相色谱分离的因素 高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩 散项B/u较小，可以忽略不计。 H=A+Cu
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化学键合固定相类型： 化学键合固定相是目前应用最广、性能最佳 的固定相。 （1）硅氧碳键型： ≡Si—O—C （2）硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐 有机溶剂，应用最广。 （3）硅碳键型： ≡Si—C （4）硅氮键型： ≡Si—N
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4.离子交换色谱（IEC）
固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或 无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂 上的交换基团的交换能力的不同而得到分离 。
∵Dm≈10-4～10-5Dg
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影响分离的主要因素有流动相的流量、 性质和极性。
①无随u降低H升高的现象（B/u） ② u降低，H降低，但无Hmin
③ u升高，H平缓升高。因Dm≈10-4～10-5Dg
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1.流速
①流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率
不大的直线。 ②降低流速，柱效提高不是很大。 ③但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度
1.流程
HPLC与GC的原理相同，只因HPLC流动相为液体， Van.Deemter方程中，组分的纵向扩散可忽略。
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GC和HPLC在分离上的主要区别： GC：流动相为惰性气体，分离主要取决于
组分分子与固定相间的作用力，主要 通过改变固定相来改变对组分的选择 性。 GLC中，流动相对组分作用极弱，一定柱温 下，固定液流失主要由高柱温造成其 自身挥发，所以，在应用中主要采用 涂渍的方法制备柱子。 GSC中，无固定液流失现象。
的六通阀进样装置。
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(4) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减
小填料粒度和柱径以提高柱效。
常用：
长度为10 ～25cm，内径为4 ～5mm。
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(5) 高效液相色谱检测器
①紫外光度检测器（UV） 最常用的检测器，可用于梯度洗脱。如固定波长型 的汞灯254nm或280nm的紫外检测器、可调波长的 氘灯或氢灯(200-400nm)。不锈钢池＜10μL。对 UV无吸收的组分不响应；对UV吸收较大，如苯不 可作流动相。
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高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统
还配有辅助装置： 梯度淋洗 自动进样 数据处理等
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2.主要部件 (1)高压输液泵
①压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的
固定相（<10μm，常用3~5μm），
液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高 效液相色谱的特点之一。 ②应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可 调、耐腐蚀等特性。
4.流动相组成 ①流动相按组成不同：分为单组分和多组分。 ②按极性不同：分为极性、弱极性、非。
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常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、
乙醇、乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相 可以灵活调节流动相的极性或增加选择 性，以改进分离或调整出峰时间。
缩短分析时间 提高分析精度
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梯度淋洗的方式： ①内梯度—高压梯度装置（目前广泛采用）
利用两台高压输液泵，将两种不同极性的 溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后 进入色谱柱。（先加压后混合）
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②外梯度— 低压梯度装置 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例混合后，再用一台高压泵输 入色谱柱中。（先混合后加压）
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HPLC：流动相与组分分子间有一定的亲和 力；分离是由组分、流动相和固定 相三者相互作用的结果。流动相是 极性不同的有机溶剂或缓冲水溶 液，溶解能力强。在HPLC中，固 定液分子必须键合在填料上，否则， 流失严重。另外，填料的颗粒 直径一般为3～5μm，柱子制备复 杂。因此，在应用中，主要以改变 流动相来调节分离的选择性。
和出峰时间的重要可选择参数。
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2.固定相及分离柱 ①气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相
色谱，其选用原则与气相色谱一样。 ②选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提
高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制 备是一项技术要求非常高的工作，一般很少 自行制备。 ③选择短柱、细内径提高分析速度。研制高效 柱填料是一活跃领域。
如：ODS (C18)，甲醇-水。 正相CBPC：极性固定相、非极性或弱极性流动相。
如：氨基柱，正己烷。
表面多孔型(球形玻珠)： 孔浅、孔层厚度小、出峰 快、柱效高，
但允许进样量小。 全多孔型(硅胶)：颗粒细、孔浅、传质 快、柱效高，允许进样量大，为前者的5 倍。
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18烷基键合固定相的形成ODS (C18 )
第十七章 高效液相色谱法
17.1 概述 17.2 高效液相色谱仪 17.3 高效液相色谱法
的分类 17.4 高效液相色谱法
的应用
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17-1 概述
高效液相色谱法的特点： 高压、高效、高速、高灵敏度。适用于高沸 点、热不稳定及生化试样的分析。
2
17-2 高效液相色谱仪
液相色谱仪（1）
3
一、流程及主要部件
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二、高效液相色谱法的类型
1.吸附色谱（液-固吸附色谱LSC） 以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等。
较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相
可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。 常用于农药成分分离、植物色素的分离等。
但不适合强极性离子型样品或同系物的分离。
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2.分配色谱（液-液分配色谱 LLPC） 通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,
（4）凝胶具有许多尺寸的孔径。 KD=[Cs]/[Cm] 当KD=1时，为凝胶的渗透极限； 当KD=0时，为凝胶的排阻极限。 不同尺寸样品分子的分布系数KD总保持 在0-1.0之间。
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5.选择流动相时应注意的几个问题 ①尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂
质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 ②避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降
或损坏柱子 ③试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产
生沉淀并在柱中沉积。 ④流动相同时还应满足检测器的要求。当使用
紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。