【实验结果与数据处理】
表 1 扩展剂前沿上升速度 X（min） Y（cm） 0 0 5 0.8 10 1.5 15 2.15 20 3.75 30 4.85 40 5.9 60 7.9 90 8.88 … ... 15
表 2 各种氨基酸的 Rf 值 赖氨酸 原点到层析斑点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离 Rf 判断待测氨基酸 【实验结论】 通过实验可以知道每种氨基酸的在扩展剂中的移动速率是不相同的，利用每种氨基酸 在纸上的位置不同可以计算出氨基酸的 Rf 值。和标准的 Rf 值对比，得出氨基酸种类。 据此由上表 2 可知，混合氨基酸是由赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸组成。 0.11 0.88 0.12 脯氨酸 0.43 0.88 0.48 亮氨酸 0.70 0.88 0.79 待测氨基酸 0.44 0.88 0.50
赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸
【注意事项 】 ⑴.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。 ⑵.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不 宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。 ⑶.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 ⑷.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。
层析缸、毛细管、小烧杯 、量筒、培养皿 、分液漏斗、层析滤纸(新华一号)、喷雾器（或 白瓷盘） ，烘箱（或吹风机） 、铅笔、直尺 2 试剂 1)、扩展剂 40mL 将 20 mL 水饱和的正丁醇和 5 mL 醋酸以体积比 4：1 在分液漏
斗中进行混合。然后与 15mL 蒸馏水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏 斗内的扩展剂约 5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。 2)、氨基酸溶液 0．5％的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓
⑸.如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的 Rf 值十分接近时，单 向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶 剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转 90 度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分 别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴 定。
B 两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位） ，参见下图。 图 2 实验装置示意图 （4） 点样：用毛细管分别取 10mL 左右的氨基酸样品点在四个位置上。干后重复点样， 同一位置上需点 2～3 次，2～3mL/次，保证每点在纸上扩散的直径最大不超过 3mm。其 中 3 个是已知样，1 个是待测样品。 （5） 层析： 用针、 线将滤纸缝成筒状， 纸的两侧边缘不能接触且要保持平行， 参见图 1-1。 向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到 1cm 左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中 （点样的一端在下，扩展剂的液面在 A 线下约 1cm） ，罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。 当扩展剂上升到 A 线时开始计时， 每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度， 填入表 1 中。 当上升到 15～18cm，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，自然风干或用 电吹风热风吹干。 （6） 显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上 0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱 中烘烤 5 分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。 （7） 计算各种氨基酸的 Rf 值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结 果贴在实验报告上，见表 2。 （8） 以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到 15cm 时 所需要的时间。
实验内容 【实验目的】 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理，掌握氨基酸纸层析的操作方法。
【实验原理】 纸层析法（paper chromatography）通常用于蛋白质的氨基酸成分的定性和定量。1944 年 A．J．P．马丁第一次用纸层析分析氨基酸，得到很好的分离效果。到现在为止，纸层 析法已经成为定性或定量测定多肽，核酸碱基，糖，有机酸，维生素，抗生素等物质的一 种最简单易行的分离分析工具。 层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。其 原理是以滤纸为惰性支持物的分配层析，层析溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟 基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，由 于分配系数不同，结果物质在两相间不断分配而得到分离。 其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中， 点样在滤纸的一端； 再选用适当的溶剂系统， 从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的 显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用 比移值（rate of folw, Rf）来表示。 Rf=原点至层析斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离 =X/Y 在一定的条件下某种物质的 Rf 值是常数。Rf 值的大小与被测物的结构、性质、溶剂 系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用单向纸层析法分离氨基酸。 【实验器材】 1 器材
度均为 0．5％)各配置 5mL 。 3)、显色剂 50～100mL 0．1％水合茚三酮正丁醇溶液。
【实验步骤】 （1）检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内 120℃烘干。 （2）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把 盛有约 5mL 展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中， 用塑料薄膜密封起来， 平衡 20min。 （3）规划：带上手套，取宽约 10cm、高约 15cm 的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘 2～ 3 cm 处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线 A， 在直线上做 4 个记号， 记号之间间隔 2cm， 这就是原点的位置。另在距左边缘 1cm 处画一条平行于左边缘的直线 B，在 B 线上以 A、