纤维蛋白（原）降解产物测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）
主要生产工艺及反应体系的研究
一、实验目的
研究合适的纤维蛋白（原）降解产物的生产工艺和最佳反应体系。

二、实验设计思想
纤维蛋白（原）降解产物测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）原理是样本中的FDP抗原与试剂中的抗体结合，形成抗原抗体复合物，产生吸光度变化，胶乳试剂可特异性的增大该吸光度的变化，增大试剂的灵敏度。

该吸光度变化的高低与样本中的FDP的含量成正比，测定该吸光度，采用与校准品比较，即能得出样本FDP的含量。

三、主要仪器及试剂材料
1.D240全自动生化分析仪/雷杜420全自动生化分析仪
生产商:南京神州英诺华医疗科技有限公司/深圳雷杜生命科学股份有限公司
2.纤维蛋白（原）降解产物校准品
FDP含量：84μg/mL
生产商：上海捷门生物技术合作公司
批号：S2814-1
四、实验内容及程序
纤维蛋白（原）降解产物测定试剂盒主要生产工艺过程的研制及试剂盒反应体系的建立分为三个部分：生产工艺的研制、试剂盒组成的研制、试剂盒反应体系的建立。

产品拟定标准：
线性范围：在拟定线性范围内，相关系数r≥0.99；
准确度：测定已知溯源的FDP质控品，相对偏差（Bias%）≤±25%；
灵敏度：测定已知溯源的FDP质控品12次，结果CV≤20%；
精密度：测定已知溯源的FDP质控品20次，结果CV≤15%。

1.主要工艺描述
1.1原液的准备
购进商品化的高效价纤维蛋白（原）降解产物抗体致敏胶乳，将其稀释成合适的倍数，作为试剂2备用。

选择合适的缓冲体系，加入一定量的增浊剂和稳定剂作为试剂1备用。

1.2原液的验证
购进有溯源的定值校准品，在生化分析仪上，将适量的校准品加入试剂1中，在适宜的条件下，和试剂2反应，根据校准品浓度和吸光度做剂量/响应曲线，得出一条持续上升的平滑曲线，即得到合格的原液。

2.反应体系的组成及其研究
2.1购进有溯源并标示有定值的校准品；
FDP含量：84μg/ml
生产商：上海捷门生物技术合作有限公司
批号：?
2.2致敏胶乳的准备
抗体致敏胶乳：上海捷门生物技术合作有限公司提供
用实验室PBS缓冲液（0.1mol/L，PH=7.4）将其倍半稀释，分别稀释成：3.5倍、3倍2.5倍、2倍、1.5倍。

用上述已准备好的不同稀释倍数FDP抗体致敏胶乳和稀释好的校准品在生化仪上进行操作。

2.2.1实验方法
2.2.2实验结果
2.2.3实验结论
由上述测试结果可以看出，将FDP抗体致敏胶乳稀释到?倍的时候高值出现下滑，因此本试剂的最高稀释倍数为?倍,因此购进上海捷门生物技术合作公司的FDP抗体致敏胶乳，选择能够稀释?倍或以下倍数的致敏胶乳原料。

2.3缓冲体系的选择
由于致敏胶乳的稀释是PBS缓冲液，因此反应的缓冲体系也选用相同浓度和PH值的缓冲液
2.3.1PH值的选择
经过纯化的抗体在常用的缓冲液中是稳定的，PH值应保持在中性左右。

PH 在7到8之间时，保存多年，对抗体也无实质性的损害，可保证其活性的稳定性。

配制PH值分别为：7.0、7.4、7.8、8.0的PBS缓冲液，选择稀释了？倍的致敏胶乳抗体作为试剂2。

按照2.2.1中的实验方法进行操作。

2.3.1.1 实验结果
2.3.1.2实验结论
由测试结果可以看出PH在7.4的时候线性是最好的，而且各相邻浓度之间
吸光度变化明显，因此可以确定PH为7.4时，是最佳的反应环境。

2.3.2稳定剂的选择
叠氮钠价格低廉，原材供应渠道广，是实验室常用的稳定剂，用量很少。

因此选用叠氮钠1g/L。

2.3.3PEG浓度
PEG有促进抗原抗体结合的作用，很多时候抗原抗体反应缓慢，为了满足临床检测的需求会加入适当的PEG加快抗原抗体反应速度，缩短检测时间。

配制PEG浓度：0%、0.5%、1%、1.5%、2%的PBS缓冲液，并将配制好的缓冲液作为试剂1备用。

选择稀释了3倍的致敏胶乳作为试剂2，按2.2.1方法操作。

2.3.3.1实验结果
2.3.3.2实验结论
由测试结果可以看出PEG浓度在0%的时候，线性是最好的，而且各相邻浓度之间吸光度变化明显，因此可以确定PEG的浓度为0%时是最佳浓度。

3.样本的要求
静脉采血，将枸橼酸钠（0.11mol/L）与全血以1:9混合，避免气泡产生。

立即离心，不小于3000转/分，离心10分钟，收集上层血浆。

如不能使用新鲜血浆，可在2-8摄氏度保存2天，或在-20摄氏度分量冰冻，避免反复冻融。

4.试剂用量
确定R1和R2试剂加入的最佳比例。

按确定的配方配制R1与R2试剂，并按产品标准要求，用校准品按照2.2.1方法进行检测，比较各比例试剂的吸光度。

4.1 实验结果
4.2 实验结论
由测试结果可以看出试剂用量比例为225:75时线性是最好的，而且各相邻浓度之间吸光度变化明显，因此可以确定试剂比例为225:75为最佳比例。

5. 样本用量
取配制合格的R1、R2试剂，用校准品检测，样本用量分别按3ul 、5ul 、7ul 、10ul 进行，R1和R2的用量为225:75，按照2.2.1
方法检测，比较各个样本量的吸光度值。

5.1 实验结果
5.2 实验结论
由测试结果可以看出样本量为5ul 时线性是最好的，而且各相邻浓度之间吸光度变化明显，因此样本量为5ul 时是最佳的反应量。

6. 反应条件
因为免疫试剂是模仿体内反应，因此做一下几种温度的研究，25℃、37℃、40℃。

6.1 实验结果
6.2实验结论
由测试结果可以看出，温度为25℃反应很缓慢，吸光度偏小，温度为40℃反应很迅速，但是高值分不开，温度为37℃时反应速度适宜，测试结果的线性也比较好，因此最佳的温度确定为37℃。

五、结论
综上所述，反应体系成分组成如下：
一、胶乳凝集实验方法
1．胶乳凝集实验：先加受检标本，滴于反应板上，再加致敏胶乳1滴，连续摇动2-3min后观察结果。

胶乳凝集者为阳性，不凝集者为阴性。

同时需做阴、阳性对照。

2．胶乳凝集抑制实验：在反应板上先加受检标本1滴，再加1滴配对抗血清混匀，最后加1滴致敏胶乳悬液，连续摇动2-3min观察结果。

胶乳凝集者为阴性，不凝集者为阳性。

同时需做阴、阳性对照。

二、致敏胶乳试剂的制备（物理吸附法）
1．先用蒸馏水将10%胶乳悬液稀释至1-2%。

继将吸附物（抗原或抗体）溶于pH8.2硼酸缓冲盐水或pH8.2甘氨酸缓冲盐水中，逐滴加入稀释的胶乳悬液中，摇动使之充分混匀。

1%胶乳悬液1ml，一般能吸附0.1-1mg物质。

2．放置室温或37℃30-60min。

3．吸附完后，4000r/min离心30-45min，弃去上清液，沉淀仍用同一缓冲盐水恢复悬浮状态。