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同位素应用

应用编辑同位素示踪法在生物化学和分子生物学中的应用放射性同位素示踪法在生物化学和分子生物学领域应用极为广泛,它为揭示体内和细胞内理化过程的秘密,阐明生命活动的物质基础起了极其重要的作用。

近几年来,同位素示踪技术在原基础上又有许多新发展,如双标记和多标记技术,稳定性同位素示踪技术,活化分析,电子显微镜技术,同位素技术与其它新技术相结合等。

由于这些技术的发展,使生物化学从静态进入动态,从细胞水平进入分子水平,阐明了一系列重大问题,如遗传密码、细胞膜受体、RNA-DNA逆转录等,使人类对生命基本现象的认识开辟了一条新的途径。

下面仅就同位素示踪技术在生物化学和分子生物学中应用的几个主要方面作一介绍。

物质代谢的研究体内存在着很多种物质,究竟它们之间是如何转变的,如果在研究中应用适当的同位素标记物作示踪剂分析这些物质中同位素含量的变化,就可以知道它们之间相互转变的关系,还能分辩出谁是前身物,谁是产物,分析同位素示踪剂存在于物质分子的哪些原子上,可以进一步推断各种物质之间的转变机制。

为了研究胆固醇的生物合成及其代谢,采用标记前身物的方法,揭示了胆固醇的生成途径和步骤,实验证明,凡是能在体内转变为乙酰辅酶A的化合物,都可以作为生成胆固醇的原料,从乙酸到胆固醇的全部生物合成过程,至少包括36步化学反应,在鲨烯与胆固醇之间,就有二十个中间物,胆固醇的生物合成途径可简化为:乙酸→甲基二羟戊酸→胆固醇又如在研究肝脏胆固醇的来源时,用放射性同位素标记物3H-胆固醇作静脉注射的示踪实验说明,放射性大部分进入肝脏,再出现在粪中,且甲状腺素能加速这个过程,从而可说明肝脏是处理血浆胆固醇的主要器官,甲状腺能降低血中胆固醇含量的机理,在于它对血浆胆固醇向肝脏转移过程的加速作用。

物质转化的研究物质在机体内相互转化的规律是生命活动中重要的本质内容,在过去的物质转化研究中,一般都采用用离体酶学方法,但是离体酶学方法的研究结果,不一定能代表整体情况,同位素示踪技术的应用,使有关物质转化的实验的周期大大缩短,而且在离体、整体、无细胞体系的情况下都可应用,操作简化,测定灵敏度提高,不仅能定性,还可作定量分析。

在阐明核糖苷酸向脱氧核糖核苷酸转化的研究中,采用双标记法,对产物作双标记测量或经化学分离后分别测量其放射性。

如在鸟嘌呤核苷酸(GMP)的碱基和核糖上分别都标记上14C,在离体系统中使之参入脱氧鸟嘌呤核苷酸(dGMP),然后将原标记物和产物(被双标记GMP 掺入的dGMP)分别进行酸水解和层析分离后,测定它们各自的碱基和戊糖的放射性,结果发现它们的两部分的放射性比值基本相等,从而证明了产物dGMP的戊糖就原标记物GMP的戊糖,而没有别的来源,否则产物dGMP的碱基和核糖的比值一定与原标记物GMP的两部分比值有显著差别。

这个实验说明戊糖脱氧是在碱基与戊糖不分记的情况下进行的,从而证明了脱氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接转化而来的,并不是核糖核苷酸先分解成核糖与碱基,碱基再重新接上脱氧杭核糖。

无细胞的示踪实验可以分析物质在细胞内的转化条件,例如以3H-dTTP为前身物作DNA掺入的示踪实验,按一定的实验设计掺入后,测定产物DNA 的放射性,作为新合成的DNA的检出指标。

动态平衡的研究阐明生物体内物质处于不断更新的动态平衡之中,是放射性同位素示踪法对生命科学的重大贡献之一,向体内引入适当的同位素标记物,在不同时间测定物质中同位素含量的变化,就能了解该物质在体内的变动情况,定量计算出体内物质的代谢率,计算出物质的更新速度和更新时间等等。

机体内的各种物质都在有大小不同的代谢库,代谢库的大小可用同位素稀释法求也。

生物样品中微量物质的分析在放射性同位素示踪技术被应用之前,由于制备样品时的丢失而造成回收率低以及测量灵敏度不高等问题,使得对机体正常功能起很重要作用的微量物质不易被测定。

近年来迅速发展、应用愈来愈广泛的放射免疫分析(radioimmunoassay)技术是一种超微量的分析方法,它可测定的物质300多种,其中激素类居多,包括类固醇激素,多肽类激素,非肽类激素,蛋白质物质,环核苷酸,酶,肿瘤相关的抗原,抗体以及病原体,微量药物等其它物质。

最近邻序列分析法(Nearest neighbour-sequence analysis method)放射性同位素示踪技术,是分子生物学研究中的重要手段之一,对蛋白质生物合成的研究,从DNA复制、RNA转录到蛋白质翻译均起了很大的作用。

最近邻序列分析法应用同位素示踪技术结合酶切理论和统计学理论,研究证实了DNA分子中碱基排列规律,在体外作合成DNA的实验:分四批进行,每批用一种不同的32P标记脱氧核苷三磷酸,32P标记在戊糖5'C的位置上,在完全条件下合成后,用特定的酶打开5'C-P键,使原碱基上通过戊糖5'C 相连的32P移到最邻近的另一单核苷酸的3'C上。

用最近邻序列分析法首次提出了DNA复制与RNA转录的分子生物学基础,从而建立了分子杂交技术,例如以噬体T2-DNA为模板制成[32P]RNA,取一定量T2-DNA和其它一些DNA加入此[32P]RNA中,经加热使DNA双链打开,并温育,用密度梯度离心或微孔膜分离出DNA-[32P]RNA复合体测其放射性,实验结果只有菌体T2的DNA能与该[32P]RNA形成放射性复合体。

从而证明了RNA与DNA模板的碱基呈特殊配对的互补关系,用分子杂交技术还证实了从RNA到DNA的逆转录现象。

此外,放射性同位素示踪技术对分子生物学的贡献还表现在:⑴对蛋白质合成过程中三个连续阶段,即肽链的起始、延伸和终止的研究;⑵核酸的分离和纯化;⑶核酸末端核苷酸分析,序列测定;⑷核酸结构与功能的关系;⑸RNA中的遗传信息如何通过核苷酸的排列顺序向蛋质中氨基酸传递的研究等等。

为了更好地应用放射性同位素示踪技术,除了有赖于示踪剂的高质量和核探测器的高灵敏度外,关键还在于有科学根据的设想和创造性的实验设计以及各种新技术的综合应用。

在生命科学中的应用同位素示踪方法的应用,使人们可以从分子水平动态地观察生物体内或细胞内生理、生化过程,认识生命活动的物质基础。

例如,用C、O等同位素研究光合作用,可以详细地阐明叶绿素如何利用二氧化碳和水,什么是从这些简单分子形成糖类等大分子的中间物,以及影响每步生物合成反应的条件等。

又如,通过采用C、H、P等同位素对核酸同蛋白质相互关系的研究,不但可以了解生物体内生成核酸和蛋白质的复杂过程,甚至可以了解生物遗传是如何实现的,乃至探讨人工改造遗传特征的可能性,因而产生了分子遗传学及遗传工程等新学科(见同位素示踪在生命科学中的应用)。

在工业上的应用在工业生产中,示踪原子为使用多种高效能的检验方法及生产过程自动控制的方法提供了可能性,解决了不少技术上和理论上的问题。

下面列举几种主要应用。

确定扩散速度金属间扩散的速度随温度而变。

如用电镀的方法将Ag、 Cu或 Zn沉积在另一种金属片的表面上,在特定温度中处理一定时间后,再从该金属片依序切下许多薄层,用探测仪器或放射自显影法测定每层的放射性,便可确定银、铜或锌在上述金属片内扩散的速度,以及温度对各种金属穿透深度的影响。

测定机械磨损用中子照射使易磨损部位的材料活化,通过测定磨下的碎屑的放射性,即可测定磨损量。

测定流体流速某一时刻在流管上端某处注入少量示踪剂,在流管下端另一处测定示踪剂的到达时间,再根据两处的距离即可测定流体的流速。

如测定石油在输油管中的流速等。

合金结构分析在一定比例的镍、铬、钨混合物中,加入少量放射性W,经熔炼后,将合金表面磨光,上面覆盖底片,进行放射自显影。

所得图谱显示,钨在合金中分布成树枝状的斑纹。

用这种方法,可以研究金属在不同冶炼过程中(或合金在热处理前后)的结构变化。

在医学上的应用在医学上,同位素示踪主要用于诊断疾病。

例如,利用同位素示踪剂被稀释的原理测定水容量、血容量;利用示踪剂移动及其速度测定血流量、肾功能、心脏功能、血栓形成、消化道失血;利用组织器官摄取示踪剂的数量检查甲状腺功能、发现肿瘤;利用示踪剂在组织器官的分布获得脏器影像、胎盘定位;利用示踪剂同相应被测物质对某一试剂竞争结合的原理或体内元素被粒子、光子等活化的原理测定体内或血、尿等标本中的微量成分;利用示踪剂在体内被代谢的程度或速度测定胃肠道吸收、肝功能、红细胞生成及其寿命。

已用于医学的同位素不下一百余种,其中最常用的有Tc、I、I、I、P、Cr、Fe、H、In 等(见核医学)。

在农业及畜牧业上的应用示踪方法广泛应用于农业科学研究,并产生了巨大的经济效益。

最主要的成果有施肥途径和肥效的研究;杀虫剂、除莠剂对昆虫和杂草的生物作用;植物激素,生长刺激素对农作物代谢和功能的影响;激素、维生素、微量元素、饲料、药物对家畜生长和发育的影响;以及用同位素标记昆虫、寄生虫、鱼及动物等所发现的这些大小动物的生命周期、迁徙规律、交配和觅食习性等(见放射性同位素在农业上的应用)。

其他应用在物理、化学等自然科学和日益受到重视的环境科学中,示踪方法也得到广泛应用。

下面是一些主要的应用例子。

超薄厚度的测定例如在用暗视野检查的电子显微镜标本上,常用真空蒸发的方法涂一层镉的薄膜。

加微量具有放射性的Cr到镉中,测定一定面积薄膜的放射性。

另外把含有不同重量的同一标记物的溶液在相同面积上蒸干并计数,作为标准。

比较薄膜样品和标准的放射性,就可测出薄膜的重量,从而求出其厚度。

此法可测出厚度薄至2.5×10m的量级。

溶解度的测定把已知放射性比活度(见放射性)的Ba标记的硫酸钡溶于水中;当溶液达到饱和以后,取出一小部分来测量其放射性比活度。

从测得的放射性比活度,就可算出单位体积内硫酸钡的含量或硫酸钡的溶解度。

化学反应的历程例如在酯类的水解过程中,究竟是酰基-氧键(a)断裂,还是烷基-氧键(b)断裂呢,用含有的氢氧化钠水溶液进行皂化后发现,标记原子进入到水后生成酸分子,而不进入到醇分子中去。

这充分证明了,反应中被打开的是酰基-氧键,即是在a处断开的。

环境污染的检查例如在制造荧光灯等接触汞的工业,需要探测空气中汞的浓度,以保证工人不会发生汞中毒。

很方便的方法,就是用Hg来标记汞,然后用探测仪器测量车间空气中的放射性,检查汞有否超过最高允许浓度。

放射性核素也可用作监测沿海污染的手段。

例如,以Br标记的溴化铵作为示踪剂,模拟释放到海洋中去的污水。

将此示踪剂被注入到污水出口处,它的扩散和途径,反映了污水在大海中的稀释和运输。

在不同水路测出的放射性位置及强度,代表特定情况下的水流图案。

最后,依靠稀释曲线、水流方向及速度以及污染指示剂的消失率等数据,编成海岸不同位置的污染统计资料。

水利学考察海洋湍流和大风对水流泥沙迁徙的影响是水利学工作经常需要考察的对象之一。

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