饲养细胞的制备 饲养细胞：融合成功的杂交瘤细胞很少，加入滋养细胞可帮 助杂交瘤细胞生长，而滋养细胞本身生长一段时间后会自然死亡。 加入的细胞称之为饲养细胞。（Feeder cell）。主要有小鼠腹 腔巨噬细胞和小鼠胸腺细胞。应用腹腔巨噬细胞的优点：做饲养 细胞，巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的 生长造成良好的环境。
选用HAT 选择性培养的目的： 免疫小鼠的脾细胞及小鼠骨髓瘤细胞经融合剂作用后，形成具 有五种细胞成分的复合体。除了所需要的杂交瘤细胞外，还包括骨 髓瘤细胞之间或脾细胞之间互相融合而成的四倍体细胞以及未融合 的骨髓瘤细胞及脾细胞，这些细胞都应被清除。采用加有次黄嘌呤 （H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的HAT 选择性培养基， 即可达到选择保留所需的如何细胞的目的。
叁
单克隆抗体制备原理
用细胞融合技术将经抗原致敏且能分泌某种抗体的B 淋巴细胞（免疫动物B 细胞）与能够长期生长的骨髓瘤细 胞融合形成杂交瘤细胞，这种融合的杂交瘤细胞称为B 淋 巴细胞杂交瘤细胞。由于每一个产生抗体的细胞只能产生 单一的特异性抗体，因此杂交瘤细胞既具备了B细胞产生 特异性抗体的能力，同时又保留了瘤细胞长期增殖的特性。
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 脾细胞脾细胞 骨髓瘤细胞 骨髓瘤细 胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
筛选出
HAT 选择性培养的原理： 在细胞内DNA合成一般有两条途径，主途径是在细胞内由糖 和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途 径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下， 经酶催化作用合成DNA。在含有 HAT 的培养液中，细胞合成核酸 的主要途径被氨基喋呤所阻断，而用于细胞融合的骨髓瘤细胞均 经8-氮鸟嘌呤筛选而缺乏HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶）或TK（胸腺嘧啶核苷激酶），因此它们合成核酸的补救途径 也被阻断；脾细胞虽然含有HGPRT,但他们在体外只能存活5~7d； 只有骨髓瘤细胞与脾细胞融合后所形成的杂交瘤细胞，因能从脾 细胞中获得所缺乏的酶类，又有组织培养条件下生长能力，故在 含有HAT 的培养液中通过补救途径合成核酸而继续生长繁殖。
贰
单克隆抗体的概念
单克隆抗体：一种抗体分子是由一个B 淋巴细胞分 化增殖而形成的浆细胞系产生的。由一个细胞增殖而形 成的具有相同遗传特征的细胞群叫做“克隆”。由一个 浆细胞大量增殖形成的克隆产生的抗体称单克隆抗体 （Monoclonal antibody，McAb）。这种抗体分子组成 均匀，特异性单一。用杂交瘤技术制备出来的单克隆抗 体纯度高、专一性强、效价高。
杂交瘤细胞的筛选 融合后的细胞在含有HAT 培养基中培养后，即有部分培养孔 出现杂交瘤集落，但其中仅部分是分泌针对预定特异性抗体的杂 交瘤细胞。在培养7~10d 后，用低倍镜观察，杂交瘤细胞的集落 长成约占1/3~1/2 视野面积时，即可取培养上清进行特异性抗体 的检测，确定有无分泌McAb 的能力，以便及时进行细胞克隆化。 由于融合后，细胞上清份数多，但每份体积有限，因此ELISA（酶 联免疫吸附试验）是最适合用于初步筛选的方法。
单克隆抗体的大量制备 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培 养时间的延长，易发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。 抗体制备有两种方法： 1.增量培养法：即将克隆化的细胞在体外进行大量培养，收集上清 液而获得大量的单一的克隆化抗体。 2.小鼠腹腔接种法:最普遍采用的方法。杂交瘤细胞具有从亲代淋 巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小 鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始 无限地繁殖，直至宿主死亡。（近年来世界范围内单抗用量过多， 世界年需数百万只小鼠，在生产中还给实验动物带来极大痛苦，出 于人道主义，荷兰、德国已禁止使用该技术，美国、英国、加拿大、 瑞士等国也加强了对该技术使用的限制，因此用于细胞培养的生物 反应器有了较快发展）
单克隆抗体的鉴定 （1） 杂交瘤细胞染色体的检查 ：采用秋水仙素裂解法进行。 （2） 单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig 类型和 亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA 夹心法测定单抗的Ig 类型和亚型。 （3） 单抗的特异性鉴定 ：可以采用各种方法，如免疫荧光法、 ELISA 法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验 等。 （4） 单抗的效价测定： 可采用凝集反应、ELISA 或放射免疫测 定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效 价。采用凝集反应，腹水效价可达5×104。而采用ELISA 检查，腹 水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。 (5） 必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。
杂交瘤细胞的亚克隆化 经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到 单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。 因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和 空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时 间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化 的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突 变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以 需要再次或多次克隆化培养。克隆化的方法很多，包括有限稀释 法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
免疫动物：以小鼠为例，正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体 的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107 种 不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合， 只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得 到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B 淋 巴细胞大量增加。一般，一次免疫难以达到预期效果，故通常要 对小鼠进行首次免疫，加强免疫，冲击免疫，加强免疫可做多次。
细胞融合 概念：通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核 或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交 （cell hybridization）。 诱导细胞融合的方法：灭活的仙台 病毒法融合、PEG法（应用最广）、电融合法、离心、振动等。 PEG：聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700 时，呈无 色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000 时，呈乳白色蜡状 固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许 多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分 子量为4000 者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％ NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子 量过大，则粘性太大，不易操作。
杂交瘤的冷冻保存及复苏 选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻 存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱 则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。 二甲基亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏 后的活性多在50％～95％之间。
伍 单克隆抗体的应用
脾细胞的制备 冲击免疫后3 天（免疫以后7~8 天，虽然是抗体产生的高 峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般 认为冲击免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。），摘除小 鼠眼球放血并收集。 收集的血液离心，血清留作阳性对照。按 无菌操作规程取出脾脏，压碎研磨,加入无血清的培养液，清洗 离心，悬浮备用。
分泌抗体 短命
不分泌抗体 长命
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
在HAT 培养基的选择作用下，只有融合成功 的杂交瘤细胞才能顺利生长，经过反复的免疫学 检测和大量细胞培养，最终获得既能产生所需抗 体、又能不断繁殖的纯系杂交瘤系。将这种细胞 扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其后产生的腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
壹 贰 叁 肆 伍
单克隆抗体技术的历史 单克隆抗体的概念 单克隆抗体制备原理 单克隆抗体制备过程 单克隆抗体的应用
壹
单克隆抗体技术的历史
1975 年，Kohler 和Milstein 应用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊细胞 致敏的小鼠脾细胞融合，得到的一部分融合杂交细胞既能继续生 长，又能分泌抗羊红细胞抗体，将这种杂交细胞系统称为杂交瘤， 应用这种方法可制备单一抗原决定簇的单克隆抗体，创立了单克 隆抗体技术，获1984 年诺贝尔奖。
杂交瘤细胞的选择性培养 将经PEG 处理并在CO2 孵箱培养24h 的融合后的细胞悬浮 于HAT 培养液中，再送回到CO2孵箱培养。每2~3d 更换培养液 一次，1 周后改用HT 培养液（HT是次磺嘌呤和胸腺嘧啶核苷的 混合剂，溶解后用培养液稀释，作为DNA补救合成途径的补充剂 用于杂交瘤筛选培养基的添加剂和营养添加剂以克服细胞内残 留氨基喋呤对DNA经典合成途径的抑制作用），2 周后改用15% 小牛血清的完全培养液。
骨髓瘤细胞的制备 选择骨髓瘤细胞的条件：①两者同系 ②稳定，易培养 ③自身不分泌免疫球蛋白 ④融合率高 ⑤是HGPRT缺陷株 ⑥生长速度快，繁殖时间短。 现有的小鼠骨髓瘤细胞株大多数是 MOPC-21 细胞株的后 代，它的HGPRT 缺陷细胞亚株在Milstein 实验室建立，简称 为X63。Kohler 等人在此基础上进一步诱发出完全不分泌免疫 球蛋白的P3.653 和SP2/0 等。应用最多的是 Sp2/0 细胞株。 该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间通常为10～15h。为 了防止出现返祖现象，骨髓瘤细胞株在融合前应先用含 8-氮 鸟嘌呤的培养基作适应培养。
8-氮鸟嘌呤
骨髓瘤细胞 （毒性核苷酸） DIE
骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞 （正常核苷酸）
LIVE
骨髓瘤细胞
脾细胞 HAT 培养基 骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
一段时间后死亡
长期存活
脾细胞脾细胞 一段时间后死亡
杂交瘤细胞
肆
单克隆抗体制备过程
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 抗原制备 免疫动物 骨髓瘤细胞的制备 饲养细胞的制备 脾细胞的制备 细胞融合 杂交瘤细胞的选择性培养 杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞的亚克隆化 单克隆抗体的鉴定 性抗原的发现及提纯 2、单克隆抗体的导向治疗 3、病理组织定位诊断中的应用 4、用于淋巴细胞分类、鉴定、结构与功能的研究 5、临床生化诊断中的应用 6、应用抗T 细胞McAb 可防止器官移植排斥反应及治疗某些 自身免疫