亲和色谱应用于天然活性成分筛选的研究进展[摘要]亲和色谱法（affinity chromatography）是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。
利用化合物和固定相表面之间的某种特异性亲和力，将目标化合物从大量无亲和活性的化合物中分离出来。
该方法可同时进行色谱分离和活性筛选，作为一种高通量筛选方法广泛应用于各种活性药物的筛选。
该文主要针对亲和色谱的发展历史、筛选技术类型及其在天然活性成分筛选中的应用进行了综述。
并就其应用前景进行讨论，以期更好地发挥亲和色谱在药物筛选中的应用。
[关键词]亲和色谱;筛选;天然药物;细胞膜色谱;脂筏色谱Progresses in screening active compounds from herbalmedicine by affinity chromatographyFENG Ying-shu<sup>/1</sup>，TONG Shan-shan<sup>/1</sup>，XUXi-ming<sup>/1</sup>，YU Jiang-nan1，2* （1. Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China;2. College of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）[Abstract]Affinity chromatography is a chromatographic method for separating molecules using the binding characteristics of the stationary phase with potential drug molecules. This method can be performed as a high throughput screening method and a chromatographic separation method to screen a variety of active drugs. This paper summarizes the history of affinity chromatography，screening technology of affinity chromatography，and application of affinity chromatography in screening bio-active compounds in herbal medicines，and then discusses its application prospects，in order to broaden applications of the affinity chromatography in drug screening.[Key words]affinity chromatography; screening; herbal medicines; cell membrane chromatography; lipid raft stationary phase chromatographydoi：10.4268/cjcmm20150609中药种类众多，配伍复杂，而有效成分是其发挥治疗作用的物质基础，从天然药物中寻找活性成分一直是中药研究的重要方向之一。
然而，应用传统的天然药物分离提取方法，即先对其成分进行分离，再结合药理药效试验筛选其中特定的有效成分的方法筛选中药活性成分，周期长，且命中率相对较低。
将化合物分离鉴定手段与高通量药物筛选技术相结合，可以直接对天然药物的提取组分进行分离并在线活性检测，不仅可以节约成本，提高天然药物活性筛选速度，同时也在一定程度上阐述作用机制，以保证研究目标的准确性。
亲和色谱法（affinity chromatography）是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法<sup>[1]</sup>。
在亲和色谱中，将能与潜在药物（配体）特异结合的物质（配基）固定于色谱填料上，制备色谱柱，混合物经过色谱柱时，能与固定相产生特异结合的物质将在色谱柱上发生保留行为，从而实现混合物间以亲和性为基础的分离。
中药提取物可不经过分离步骤，直接在相应的亲和色谱上完成筛选工作。
并且药物在亲和色谱模型上的的保留特性（保留时间或容量因子）与药物的活性显著相关。
本文主要针对亲和色谱的发展历史、筛选技术类型及其在天然活性成分筛选中的应用进行了综述。
1亲和色谱的发展历史亲和色谱的发展经历了上百年的历史<sup>[2]</sup>，现已成为一个较为成熟的技术，广泛应用于天然生物活性物质的分离和纯化，以及筛选和鉴定。
早在1910年，德国药理学家Starkenstein将蔗糖酶抗体吸附在高岭土上，研究了抗体和抗原的相互作用，为亲和色谱的萌芽。
1924年，俄罗斯学者Engelhardt提出了“固定化配体原理”，作为分离生物活性物质的方法，为亲和色谱分离方法的根本。
随后的60年间，人们相继使用亲和色谱技术，分离纯化淀粉酶、抗体等，在此期间，纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、苯乙烯树脂等基体材料以及各种配基的固定化方法的出现，亲和色谱技术飞速发展。
1968年，美国药理学家Cuatrecases和Wilchek扩展了亲和配位体的范围，包括酶、抗原、抗体、激素、维生素、外源凝集素、糖蛋白、膜蛋白、病毒、细胞等，确立生物特效亲和色谱方法。
1970年，Cuatrecases提出了“空间间隔臂”概念和方法，成功解决了配位体的立体可接受性问题。
1972年，德国学者Wulff提出分子印迹色谱方法，进一步扩展了亲和色谱的应用，使得亲和色谱开始用于药物筛选研究。
随后的30年间，共价色谱方法，染料配位色谱方法，电荷转移色谱方法，定位金属例子亲和色谱方法、包合配合物色谱方法相继提出。
1978年瑞典学者Ohlson提出以大孔微粒硅胶作为载体的高效液相亲和色谱方法，使得亲和色谱的发展跨入了一个新的时代。
上述关于亲和色谱技术的发展虽然并非直接用于天然药物的筛选，但是其对现代药物筛选技术的建立、发展和应用奠定了十分重要的理论基础与技术支撑。
经过几十年亲和色谱相关技术的发展，随着HPLC色谱柱制备技术以及各种在线联用技术的广泛应用，以及更多亲和配基的基础研究的深入，近十多年来逐步衍生出了众多基于不同配基的亲和色谱技术，并在天然药物的筛选领域发挥了越来越重要的作用。
根据配基的种类和筛选模型的不同，常用的亲和色谱筛选技术包括：以受体、酶、蛋白或DNA为配基的亲和色谱筛选技术、细胞膜色谱筛选技术、脂筏色谱筛选技术、分子印迹技术等。
各种亲和色谱技术在药物筛选、模式建立、分离机制等方面的特色不尽相同，其在天然药物发现和鉴定等领域的应用不断拓展，为天然活性成分的发现与临床药物开发提供了极具优势的筛选技术平台。
2亲和色谱法筛选技术亲和色谱法将能与潜在药物（配体）特异结合的物质（配基）固定于色谱填料上制备色谱柱，混合物根据色谱保留行为的不同而实现分离。
同时，亲和色谱与紫外，MS，NMR 等多种检测器联用，实现在线筛选并鉴定中药活性成分。
随着人们对亲和色谱认识的加深以及应用的推广，多种配基的亲和色谱以及不同类型的亲和色谱模型陆续被人们应用于中药活性成分的筛选。
2.1受体为亲和配基的色谱筛选近年来，随着药物作用靶点的逐步揭示，以受体为目标筛选中药中的活性成分为中药筛选的基本思路。
王序等<sup>[3]</sup>在20世纪80年代，以11个受体为指标，筛选了150种常用中药的400余种提取物，得到了5 000余种生物活性测定结果。
为了解中医用药的机制提供了一些实验依据。
然而，传统筛选方法仅根据混合物判断作用结果，无法确定具体作用物质，且工作量巨大，耗费人力物力可观。
将受体作为亲和色谱的固定相，建立亲和色谱筛选模型，天然药物提取物中能与受体发生特异结合的成分在色谱柱中发生保留，与无色谱保留行为的物质分离开来，从而实现活性筛选和色谱分离同时进行，快速、有效的发现天然药物中的活性物质。
目前用于天然药物筛选的受体为配基的亲和色谱模型有肾上腺素受体亲和色谱模型，烟碱受体亲和色谱模型等。
由于受体对配体选择性识别作用较强，以受体为配基的亲和色谱在天然药物活性成分筛选中具有较强的选择性且作用机制明确。
Wang等<sup>[4]</sup>将猪重组β2-肾上腺素受体（β2-AR）通过共价键固定在大孔硅胶表面，制成β2 -AR亲和色谱柱，使用亲和色谱方法与四极飞行时间质谱（Q-TOF-MS）联用，从中药制剂活血胶囊提取物中筛选出有效成分阿魏酸，羟基红花黄色素A（HSYA）和柚皮苷。
提取物中具有舒血管作用的β2-AR拮抗剂能与固定相中上的β2-AR发生特异性结合而产生色谱保留，与Q-TOF-MS联用，实现活性化合物的在线分离和鉴定。
然而，受体的制备及固定化工艺较为复杂，受体的蛋白质特性导致了亲和色谱使用寿命较短。
在受体固定化过程中，受体蛋白覆盖不完全会导致配体与固定相上残留基团发生非特异性结合而导致其保留特性发生变化。
郑晓晖等<sup>[5]</sup>用甘氨酸乙酯对硅胶表面残留的未反应的咪唑基进行封尾而消除非特异性吸附，并在流动相中加入Tris，EDTA和NaCl等试剂，用于消除配体与固定相上残留氨基和硅羟基之间的静电作用。
这样不仅能最大程度地保持受体的活性和选择性，又减小了固定相表面非特异性功能团的影响。
所制备的色谱柱可使用1周的时间。
合适的固定化受体的发现决定着亲和色谱药物筛选模型的应用。
E Calleri等<sup>[6]</sup>研究了固定化γ型过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）的色谱特性。
实验将PPARγ以共价键固定在氨丙基二氧化硅粒子表面，作为色谱固定相，同时，将PPARγ结合在毛细管柱表面建立PPARγ毛细管亲和色谱以研究不同固定化条件下的亲和色谱特性，以已知配体验证固定化后的PPARγ亲和色谱的结合特性。