分类号：2011届本科生毕业论文题目：乳酸中嗜热链球菌的分离及鉴定Title：Lactic acid streptococcus thermophilus cultured in the separation and identification系别：化学与生命科学学院专业：07级生物技术学生姓名：邵志国学号：2007090223指导老师：郭志华职称：讲师2011年4月17号摘要[目的]从乳酸中将嗜热链球菌分离出并进行鉴定。
[方法] 利用MRS培养基将乳酸中的菌种培养，经过革兰氏染色、镜检分离出嗜热链球菌，最后选出7株，对它进行菌落形态的观察。
最后对其进行各种理化鉴定。
[结果]镜检结果该菌为革兰氏阳性，经过生化鉴定该菌为嗜热链球菌。
关键词：乳酸；嗜热链球菌；分离；鉴定。
ABSTRACT[objective] the streptococcus thermophilus cultured from lactic acid will isolate and evaluations. [method] Use the media will lactic acid bacteria MRS cultivation, and after gram's staining, isolated anti-bma streptococcus thermophilus cultured, finally chosen for it, seven strains colony morphology observation. Finally the various physical and chemical identification. [result] microscopy results this for gram-positive bacteria, after biochemical identified the bacteria for streptococcus thermophilus cultured.Keywords: lactic acid; Streptococcus thermophilus cultured; Depart; appraisal目录绪论 (5)1 试验材料与方法 (6)1.1试验材料 (6)1.2 实验试剂 (6)1.3实验方法 (6)1.3.1乳酸菌的筛选 (6)1.3.2 乳酸菌的分离纯化 (6)1.4 理化性质的测定 (7)2 结果与讨论 (8)2.1菌落形态和细胞形态 (8)2.2生化试验结果 (11)3 小结 (12)参考文献 (13)致谢 (14)绪论乳酸菌是一类能利用可发酵的糖产生大量乳酸的细菌通称。
这类细菌广泛分布在土壤、植物根茎、湖泊及动物的体内。
酸菌从形态上可以分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性细菌。
目前，对乳酸菌的应用研究，着重于发酵乳制品、发酵食品和医药工业等人类生活密切相关的领域。
乳酸是以新鲜牛乳经有效杀菌，用不同乳酸菌发酵剂制成的乳制品。
由于该产品营养价值较高，并能改善肠道正常微生物区系的稳定，因此它已成为深受消费者青睐的营养保健食品。
在我国市场上，生产销售的各种乳酸制品中，作为发酵剂使用的乳酸菌，通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
乳酸的生产是利用原始菌种进行逐级扩大培养方式进行，即活化复壮———再进行扩大培养至乳酸菌的活力都达到可用程度后，投入生产进行发酵。
在发酵剂的活化过程中，工序多，技术要求严格，稍有不甚就会污染杂菌，通过对乳酸发酵剂嗜热链球菌的分离和鉴定能及时掌握研究进程和生产控制。
1 实验材料和方法1.1 材料和仪器乳酸：采购于超市伊利；化学试剂：均为国产分析纯。
超净工作台、酒精灯、接种环、灭菌锅等。
1.2 实验试剂MRS固体培养基：蛋白胨10 g，肉膏10 g，酵母提取物5 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，KHPO4 2 g，MnSO4.4H2O 0.25 g，MgSO4.7H2O 0.58g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，琼脂25g，水1000ml。
调PH6..2~6.4，121℃灭菌15min。
PY基础培养基：蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，盐溶液4.0 g，蒸馏水100ml。
调PH值6.0左右，113℃灭菌20min。
蛋白胨水培养基：蛋白胨5g，Nacl2.5 g，蒸馏水500ml。
调ph值7.0左右，121℃灭菌20min。
葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，KHPO4 2g，蒸馏水1000ml，调PH值7.0~7.2，过滤，121℃灭菌30min。
明胶基础培养基：蛋白胨1.0 g，酵母提取物1.0 g，葡萄糖0.1g，明胶12.0g，盐溶液4.0ml，蒸馏水100ml，ph值7.0,113℃~115℃灭菌15~20min。
可溶性淀粉培养基：向PY培养基中加入0.5%可溶性淀粉。
1.3实验方法1.3.1 乳酸菌的筛选将乳酸均匀涂布于MRS培养基平板上，37℃静置培养48h。
1.3.2 乳酸菌的分离纯化挑取培养基上的菌落，划线分离纯化2~3次，最后选择单菌落，经过镜检确认为纯种，得到7株菌株，4℃斜面保存。
将菌落平板和细胞形态在显微镜下用照相机照出。
1.4 理化性质的测定1.4.1 KOH试验用灭菌的接种环加1~2环5%的KOH溶液于干净的载玻片上，调菌于溶液中，用环将其混合搅匀，短时间内KOH试剂阳性菌会越搅越稠，抬起接种环会产生拉丝现象，而KOH阴性菌则无拉丝现象。
1.4.2 过氧化氢酶测定用灭菌的接种环加1~2环10%过氧化氢溶液于干净的载玻片上，挑菌于溶液中，搅拌均匀。
观察产气泡情况，有气泡产生，则判断为过氧化氢酶阳性反应。
1.4.3 需氧试验将分离纯化后的各菌株分别接种于高层MRS液体培养基中，37℃静置培养2d后，观察生长情况。
1.4.4 淀粉水解试验将各菌株分别接种到可溶性淀粉培养基中，37℃培养1~2天。
然后向培养液中加入3~4滴卢戈氏碘液，如不显色表示淀粉水解阳性反应，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉水解或水解不完全，为阴性反应。
1.4.5 明胶液化试验菌株接种后适温培养，观察结果时需经低温处理。
如对照管（未接种）凝固而接种管液化则为阳性反应，同时凝固或者液化为阴性反应。
1.4.6 吲哚试验向培养2d后的含菌蛋白胨水培养基内加3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min~3min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应，否则为阴性反应。
1.4.7 V-P试验将各菌株接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养2d后，向培养物内加入5~10滴40%的KOH，然后加入等量的5% ａ-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15min~30min，以加快反应速度。
若培养物成红色，则为V-P反应阳性。
1.4.8 产葡聚糖测试将菌株接种于加有10%蔗糖的MRS斜面培养基上，适温培养2~4d，如斜面培养物形成粘稠状菌苔，表明产生葡聚糖，为阳性反应，否则为阴性反应。
1.4.9 碳水化合物产酸试验采用PY基础培养基，在其中加入碳水化合物，终浓度达到1%，管内培养基高度约4~5cm。
灭菌后接入菌株各1环，37℃培养2d。
取未加入碳水化合物的培养基作为对照，结晶紫试剂比较颜色的变化记录产酸的强弱。
2 结果与讨论2.1 菌落形态和细胞分离到的7株菌，菌落乳白色、灰色或略显黄色；大而平坦或小而厚，菌落湿润且大及边缘整齐。
镜检细胞形态、大小、排列方式及革兰氏鉴定结果见表一表一 7株菌的形态特征及大小Table 1 7 strains bacteria the morphological characteristics and size 编号染色大小/um 形态排列方式1 G+ 1.0*(1.0-1.5) 椭球单个或呈短链2 G+ 1.0*(1.0-1.3) 椭球单个或成对或呈短链3 G+ 1.0*(1.0-1.4) 椭球单个或呈短链4 G+ 1.0*(1.0-1.3) 椭球单个或呈短链5 G+ 1.0*(1.0-1.4) 椭球单个或呈短链6 G+ 1.0*(1.0-1.5) 椭球单个或呈短链7 G+ 1.0*(1.0-1.5) 椭球单个或成对或呈短链从表一看出，从酸奶中分离出的7株为嗜热链球菌符合乳酸菌的特性。
下面附平板和细胞的照片嗜热链球菌的细胞形态Streptococcus thermophilus cultured cell type嗜热链球菌的菌落形态Streptococcus thermophilus cultured colony morphology2.2 生化试验检测结果对筛选的7株菌进行进一步的试验鉴定结果见表2、表3。
从表2、表3可见，所有7株菌种都能水解淀粉，KOH试验、接触酶试验、明胶液化试验、吲哚试验均为阴性，但对于多种糖的利用情况不同。
表2 7株菌株的生化试验结果Table 2 7 strains isolated biochemical test result项目 1 2 3 4 5 6 7KOH试验- - - - - - -淀粉水解+ + + + + + +接触酶试验- - - - - - -需氧试验好氧好氧兼性厌氧微好氧微好氧微好氧微好氧明胶试验- - - - - - -吲哚试验- - - - - - - V-P试验- - - - + - -产葡聚糖- - - - - - +注：“+”表示阳性反应：“-”表示阴性反应。
表3 7株菌的碳水化合物发酵产酸试验结果Table 3 7 strains bacteria carbohydrates ferment produce acid test results1 2 3 4 5 6 7碳水化合物葡萄糖+ + + + + + +麦芽糖+ + + + + + +乳糖+ + - - - + -蔗糖+ + + + + + +注：“+”表示阳性反应：“-”表示阴性反应小结市售的乳酸中的乳酸菌多为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌其中球菌较少。
采用常规的革兰氏染色、形态观察的方法对分离到的菌株进行简单鉴定,该方法操作简单、快速、实验结果可靠。
分离到的嗜热乳酸链球菌菌株经活化后可以应用到生产中。
参考文献[1]陈晓平,刘华英,魏晓川.自然发酵酸菜汁中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究[J].食品科学.2006(2):91-93.[2]杨晓晖,籍保平,李博,等.泡菜中优良乳酸菌的分离鉴定及其发酵性能的研究[J].食品科学.2005(5):130-133.[3]黄秀梨.微生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1999:58-59[4]邓放明,李罗明,尹华.碎鲜辣椒发酵制品发酵用乳酸菌的选育与接种发酵试验[J].食品科学.2005(3):106-108.[5]黄君红,成洁珊,陈青荷.乳酸菌生长最佳培养基的筛选[J],中国酿造.2001(2):9-11.致谢在本论文完成之际，首先向我的指导老师郭志华老师致以衷心的感谢和深深的敬意。