抗癌药物——紫杉醇一、前沿1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。

在筛选实验中，Wani和 Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。

由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔（Andre T. McPhail）合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol）。

紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机理，现主要用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌等癌症。

紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架和桥头双键以及众多的含氧取代基。

其全合成引起国内外许多有机化学家的兴趣。

先后共有30多个研究组参与研究，实属罕见。

经20多年的努力，于1994年才由美国的R．A．Holton与K．C．Nicolaou两个研究组同时完成紫杉醇的全合成。

随后，S．T．Danishefsky(1996年)、P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年)和I．Kuwajima(1998年)4个研究组也完成这一工作。

6条合成路线虽然各异，但都具有优异的合成战略，把天然有机合成化学提高到一个新水平。

紫杉醇是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗.紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物,其新颖复杂的化学结构、广泛而显著的生物活性、全新独特的作用机制、奇缺的自然资源使其受到了植物学家、化学家、药理学家、分子生物学家的极大青睐,使其成为20世纪下半叶举世瞩目的抗癌明星和研究重点,包括寻找新的生物资源、化学全合成、半合成、衍生物制备、生物转化、生物合成、生物工程、构-效关系研究、作用机制研究、药理学和药效学等研究.2011年是发现紫杉醇结构40周年,对紫杉醇发现的曲折历史过程进行回顾和总结,以纪念这一伟大发现并纪念为紫杉醇的研究与第二代紫杉醇的开发作出贡献的科学家。

二、紫杉醇的制备1.1 天然红豆杉植物提取紫杉醇的最直接来源是对天然植物红豆杉属种的提取红豆杉属植物共11种，我国有4种及1种变种，它们分别是云南红豆杉、西藏红豆杉（又名喜马拉雅红豆杉）、中国红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉（又名美丽红豆杉）。

由于这些植物数量极少，自身繁殖率低，生长缓慢，且紫杉醇的含量又极低（每千克干树皮最多只能得到50~150mg 的纯紫杉醇），生产1g紫杉醇需砍伐3~4棵60年树龄的大树。

在这种情况下，要获得足够的紫杉醇用于临床研究和基础研究，单纯靠从天然植物树皮中提取必将给红豆杉属植物的在自然界中的生存带来极大的威胁。

但由于从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此，人们可利用人工栽培的方法来解决天然资源不足的问题.1.2人工栽培Cociancichm发现在T.Media“Hicksii”和T.Media“ Hill ”的根中紫杉醇的含量高达0.08%~0.05%，至少是其它种属红豆杉属植物的4倍；同时，含有可作为紫杉醇半合成原料的BaccatinIII和10-Deacetyl baccatinIII的含量分别为0.02%~0.06%和 0.03%~0.08%。

由于这些植物是作为装饰植物被种植的，因而它们的栽培是很容易的，从工业上来讲，这些植物可通过大田种植，3年收割，从而为紫杉醇提供一个相对稳定和长期的来源。

美国BMS公司于1991年种植了400 万株，以后每年种植1000万株.我国云南农科院高山经济植物所繁育了5万株，成活率达94.3%，湖南绥宁县林业局繁殖幼苗3000多株，现已移栽大田，黑龙江中医药大学人工育苗也获成功。

人工植物栽培的成功，为紫杉醇的获取开辟了广阔的前景。

1.3半合成半合成法指的是将红豆杉植物中所含的紫杉醇类似物经过某些化学反应，将其转化为紫杉醇.由于BaccatinIII和10-Deacetyl baccatinIII在植物中的含量相对较高，因而半合成的研究工作主要集中在对这两种物质的研究上。

Mangatal等人采用的第一个方法研究结果不理想，他们选择的反应路线立体选择性和区域选择性都较差，但他们意外地从合成产物中发现了生物活性优于紫杉醇的紫杉醇衍生物Taxotere，其活性是紫杉醇的2.7倍，且通过化学修饰可以增强其亲水性，消除剂量限制表面活性剂，并可降低过敏性。

他们的第二个方法获得了较大的成功，最终紫杉醇的总产率达到了38% 利用取代的β内酰胺。

与相应的Baccatin衍生物缩合，可以以很高的产率得到紫杉醇，此外，Commercon 等人的合成方法也获得了较大的成功.半合成法可以更大限度地利用植物资源，但仍不能从根本上解决植物资源的匮乏问题。

1.4全合成巨大的社会效益、经济效益和极为重要的学术价值吸引了全球范围内的40多个一流的研究小组从事紫杉醇的全合成工作。

1994年初，Holto和Nicolaou几乎同时宣告紫杉醇的全合成获得成功。

二者的全合成工作完成的十分出色，但合成路线均太长，且中间步骤的收率又相差很大，导致紫杉醇的最终收率均很低。

Holto 的方法紫杉醇总收率达到了2.7%，Nicolaou的合成路线虽具有较前者简明的优点，但其总收率却远远低于前者，仅为0.07%左右。

因而目前来看，紫杉醇的化学全合成还仅具有研究意义，缺少商业价值。

1.5真菌发酵Strobel等人发现，寄生于某种红豆杉上的真菌能产生紫杉醇，尽管其产率很低，仅24~ 50*10^-9g/L，但由于真菌的基因操作比植物容易得多，因而，有可能通过传统的方法和基因工程的方法来增加紫杉醇在真菌中的产量。

另据报道，我国西安一枝刘制药公司的研究人员从中国红豆杉树皮中分离出一种真菌，使其重组诱变，通过菌种优化培养，紫杉醇和BaccatinIII在培养液中的浓度均达到2*10^-3g/L，有望实现产业化。

1.6 植物组织细胞培养利用植物细胞来生产紫杉醇是目前紫杉醇研究的另一热点. 国内外学者对此均做了大量的工作，取得了丰硕的成果。

1989年美国农业部首先发现了红豆杉的植物细胞能够产生紫杉醇并获得了专利。

美国的Phyton Catalytic公司取得此专利后，通过多种优化手段使每升发酵液中可产生1~3mg的紫杉醇. 该公司1991 年宣称该方法可在2~5年内实现商业化。

该公司的Smith等人通过分析许多种属的红豆杉愈伤组织中紫杉醇的含量后，发现我国出产的红豆杉（T.Chinensis ）培养出的愈伤组织中紫杉醇的含量远远高于其他国家出产的红豆杉所培养出的愈伤组织中的紫杉醇的含量。

Phyton Catalytic公司利用T.Chinensis组织细胞培养，最终使得紫杉醇的含量达到了0.098%；日本一个研究小组也宣称他们用T.Breifolia的愈伤组织得到了0.05%的紫杉醇。

Fett-Neto的研究小组详细研究了T.Cuspidata的组织细胞代谢、生长和紫杉醇的产生情况，取得了较为系统的实验数据。

目前对于组织细胞培养的一些工艺条件，如外植体光照、会养基组成等因素对细胞培养及紫杉醇生产的影响已基本探清，正在研究反应器的放大技术和新的技术生长点，可望实现由红豆杉细胞培养生产紫杉醇。

据报道，美国有关公司已具备生产4t 紫杉醇的技术，现正在进行20t规模的工业放大研究。

三、紫杉醇的表征1.仪器与试剂Dionex Summit HPLC高效液相色谱仪，Chrome-Leon 6．70英文版色谱工作站，P680 A LPG泵，UVD 170U紫外检测器。

红豆杉树皮样品来自新乡市紫金隆药业有限公司，样品经干燥后粉碎过40目筛，备用．99％紫杉醇由上海金和生物技术有限公司提供。

乙腈为色谱级，其余试剂均为国产分析纯试剂：超纯水。

2.方法与结果2．1色谱条件250 mm×4．6 mm，5 µm)，流动相V(乙腈)：V(水)=50： Agilent色谱柱(型号TC—C1850，流速1.0mL/min，紫外检测波长227 nm。

；进样量为10µL；柱温为35℃在该色谱条件下，紫杉醇被洗脱且达到基线分离，保留时间为14．749 min(见图1、图2)．根据色谱保留值规律和光谱特征吸收曲线综合定性，确定供试品液相色谱图中14．749 min峰为紫杉醇。

2．2紫杉醇对照品标准母液的制备精密称取干燥至恒重的99％紫杉醇对照品0.0250 g，用色谱乙腈(经过0．4µm 有机相滤膜过滤)溶解并定容于25 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1 000 µg／mL 的紫杉醇标准母液，4℃冰箱中贮存待测。

2．3紫杉醇溶液标准工作曲线的制备用移液管分别精密吸取上述紫杉醇标准母液O．4，0．6，0．8，1．0，1．2 mL 定容于10 mL容量瓶中，然后用色谱级乙腈分别稀释成质量浓度为40，60，80，100，120斗咖L浓度梯度紫杉醇溶液，分别取之10µL注入液相色谱仪，将峰面积y 与浓度x绘制标准工作曲线，得其回归方程：y=-1．615+0．327 6X，r=0．999，在0．04 µg～1．2µg范围内呈现良好的线性关系。

2．4供试品溶液的制备称取红豆杉树皮样品粉末10 g，加入200 mL分析级甲醇，进行索式提取(水浴温度为85℃)．经过12 h的回流，虹吸12次，浸提管中颜色逐渐变浅直至无色表明所要物质已基本提取完全。

将所提溶液进行旋转蒸发(40 o C，80 r／rain)得膏状物，用部分甲醇溶解后加50 mL蒸馏水稀释，然后用50 mL石油醚脱脂萃取3次，保留水相层；再用50 mL 二氯甲烷萃取3次后合并有机相二氯甲烷层，室温下旋转蒸发成浓缩膏，用色谱级乙腈溶解并转移至25 mL容董瓶中定容，制备液经0．45µm微孔有机相滤膜过滤，4℃冰箱中贮存。

取过滤液10µL注入液相色谱仪，将峰面积代入2．3项中紫杉醇标准工作曲线方程y=一1．615+0．327 6x(r=0．999)计算，即得供试品中紫杉醇含量。

2．5精密度试验在上述色谱条件下重复进样100µg／mL紫杉醇标准溶液6次，计算RSD为1．04％。

2．6稳定性试验取2．4项下供试品溶液，分别在1，2，4，8，16，24 h进样，RSD为1．52％，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2．7重复性试验取同一供试样品6份，按2．4项下操作，在上述色谱条件下进样测定，RSD为1.15％，表明本方法重复性好。