决定工艺采用的温度及流程时间
影响产物的回收
第二章基因工程制药part3
• 基因工程药物生产中常用的分离纯化方法
方法
目的
离心/过滤
去除细胞、细胞碎片、颗粒型杂质
阴离子交换层析 去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒
40nnm微孔膜过滤 进一步去除病毒
阳离子交换层析 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等
超滤
去除沉淀物及病毒
第二章基因工程制药part3
•包含体的分离、溶解和复性
•细胞破碎效率较重要（溶菌酶处理—高压匀浆） •固-液相分离（离心）
•去污剂或/和低浓度尿素或盐酸胍洗涤，去可溶性蛋白和膜蛋白
•高浓度尿素或盐酸胍溶解包含体，可添加DTT(二硫苏糖醇) •打开二硫键
•逐步透析或稀释去除变性剂
第二章基因工程制药part3
• 素几方式等； • ⑷ 初始物料的物理，化学和生物特性：包括产物浓度、主
要 • 杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、
流 第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
2. 物料中杂质种类和性质
•
物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电
荷性
• 质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥
•
非机械法----酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。
• ⑶ 固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和Βιβλιοθήκη 膜•过滤。
第二章基因工程制药part3
• 2. 目的产物的分离纯化
• 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术 分
• 为： • Ion exchange chromatography （IEC） • Reversed phase chromatography （PRC） • Hydrophobic interaction chromatography （HIC） • Affinity chromatography （AC）
骤，或干扰产品质量；
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四．分离纯化工艺应遵循的原则
• ⑸ 分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性 差的产物；
• ⑹ 工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件 要求低，能耗低；
• ⑺ 具有较高的安全性
第二章基因工程制药part3
• 针对不同的产物表达形式采用不同的策略
组织培养细 胞
细菌、酵母
高压匀浆 研磨
高速珠磨
细菌、酵母、 植物细胞
细菌、植物 细胞
细胞混悬液
低渗裂解 冻融裂解
红细胞、 细菌
培养细胞
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三．分离纯化的技术
• 分离纯化技术要求：
• ⑴ 技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； • ⑵ 选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物
物和
5. 副产物种类、产物在细菌内所处的位置，表达方式（胞内、
6. 胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降
解
7. 产物的酶类等；
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化 一．建立分离纯化工艺的根据
• ⑶ 生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连 续
• 、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件 因
第二章基因工程制药 part3
2020/12/10
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
基因工程药物或生物技术产品特 1. 点目的：产物在初始原料中的含量较低；
2. 含目的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还 有大量的细胞、代谢、残留物培养基、无机盐等，特别 是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大。
透析或稀释速度，温度，pH，离子强度，目的蛋白的浓 度（通常10-100微克/ml）以及目的蛋白中的杂质会影响 复性过程，甚至导致目的蛋白聚集沉淀。 对含有二硫键蛋白，采用谷胱甘肽、半胱氨酸和巯基乙胺 （cysteamine）等还原剂打开二硫键，使用过量的氧化硫氨 试剂或铜离子诱导的空气氧化可以加速二硫键氧化形成。 复性过程添加L-精氨酸有时可以大幅度提高复性效率，可 能是由于增加了复性中间体的可溶性。 复性过程添加某些去垢剂可以提高复性效率。 通过抑制分子间非特异性的相互的另一方法是使蛋白固定化 （在亲和层析柱上复性）。
• 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
•
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进
行
• 分离的；
•
凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行
分
• 离的；
•
径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离
于
• 一体复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大
的
第二章基因工程制药part3
• 多种分离纯化技术的联合运用
第二章基因工程制药part3
避免或减少包含体形成的有效方法是减缓蛋白合成速率，
如降低发酵温度、使用弱启动若启动子、降低基因剂量等。
使用亲水性蛋白作为融合伴侣可以增加融合蛋白的可溶性，
如谷胱甘肽硫转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）
和硫氧化还原蛋白（thioredoxin）后两者还具有分子内伴
•
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规
模产
• 业化过程未必合适，如：
实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）
实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产
工
艺
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• 包含体的形成：
• 原核、酵母和真核生物由于异源和同源蛋白过表达所 形成的致密的不溶性颗粒。包含体的形成与过表达蛋白的 内在性质（如分子量、折叠途径等）无直接关系。因为大 肠杆菌胞质环境是一个还原性环境，所以含有较多二硫键 的蛋白较容易错误折叠形成包含体。相比之下，周质空间 有利于二硫键的形成，但是包含体的形成也会发生。包含 体的产生有利有弊。
分离出来，达到较高纯化倍数； • ⑶ 收率要高； • ⑷ 两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或
调整，这样可减少工艺步骤； • ⑸ 整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。
第二章基因工程制药part3
• 1. 细胞破碎与固液分离
• ⑴ 细胞收集：离心和膜过滤
• ⑵ 细胞破碎：
•
机械法----高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。
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•一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用。 一是分子内的疏水相互作用，二是部分折叠的肽链分子间 的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋 白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。 因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止 聚集，是提高复性收率的关键。
离子交换 分辨率通常较高；流速较快 最适于早期纯化，即大体积 （合适的填料）；容量很大， 样品且蛋白纯度较低时使用 样品体积不受限
发性
• 、吸附性能等。
3. 目的产物特性
4. 产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对 分
5. 子量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水 第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
4. 产品质量的要求
5. 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的 要
6. 求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种 类
疏水层析
去除残余的杂蛋白
凝胶过滤
与多聚体分离
0.22μm微孔膜过滤 除菌
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四．分离纯化工艺应遵循的原则
• ⑴ 具有良好的稳定性和重复性； • ⑵ 尽可能减少组成工艺的步骤； • ⑶ 组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，
工艺和设备相适应。 • ⑷ 在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步
侣作用，在细胞内过表达分子伴侣蛋白，促进外源蛋白的
正确折叠。
过表达二硫键异构酶可以促使蛋白的正确折叠，大肠杆菌
周质空间的DsbA蛋白的作用是引入新的二硫键，但是不催
化异构，DsbC是一种二硫键异构酶。
在培养基中加入硫醇也可以促进打开错配的二硫键，形成正
确的折叠蛋白。
第二章基因工程制药part3
第二章基因工程制药part3
• 产物的主要特性及在分离纯化中的作用
产物特征
作用
等电点 疏水性 特殊反应性 聚合性 生物特异性 溶解性 稳定性 微不均一性
决定离子交换的种类及条件
与疏水、反相介质结合的程度
产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制
是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体
决定亲和配基
决定分离提系及蛋白浓度
•
在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种
技
• 术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用
应首先选择能除去含量最多杂质的方法
应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
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• 分离纯化过程的规模化
7. 和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存 稳
8. 定性等。
第二章基因工程制药part3
二．分离纯化的基本过程
• 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细 胞
• 生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。 • 基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，
包
• 括 细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高 度
分离原理
分子大小
电荷 等电点 疏水特性
生物亲和性
常用的蛋白质、酶和重组蛋白质纯化技术