DNA片断，主要产生3种末端结构：
5ˊ－粘性末端
3ˊ－粘性末端
平端或钝端
回文序列(palindrome) 是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复; 粘性末端(sticky end) 是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和 3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。
HindⅡ GTCGAC CAGCTG
（三）、基因工程的研究内容
基因工程（genetic engineering ）是指在基因水 平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类 的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种 新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后 代。
二、基因工程相关概念及基本工具
（一）、基因工程的相关概念
1.克隆与克隆化 克隆指同一副本或拷贝集合。从众多不同的分子群体中分离 的某一感兴趣分子，经扩增产生很多相同分子集合，即为分 子克隆。
大肠杆菌 RY13株的第一种酶

第一个字母取自产生该酶的细菌属名第一个字母，用大写； 第二、第三个字母是该细菌种名的前两个字母，用小写； 第四个字母代表菌株类型； 如果菌株有几种酶，在代表菌株的字母后用罗马数字表示。
(4)Ⅱ类酶识别序列特点——
回文结构(palindrome)
特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
2.基因工程载体
为了使DNA片段能在宿主细胞中得以扩增，须将其接到一个特 定能够进行自我复制的载体分子上。Lederberg开始从事细菌 性因子（F因子）研究。20世纪50-60年代，相继发现其他质 粒，如抗药性基因（R因子）和大肠杆菌因子（CoE）。这些 工作为基因工程载体系统的建立打下基础。
3.基因的体外重组技术
(TaqDNA polymerase) 作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 75℃，
2） 95℃以上高温，半小时不失活，
3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。
4.逆转录酶
特点
逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶 活性： ⑴
⑵
以单链RNA为模板， 催化合成cDNA单链
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+
GATCC
G
(2) 分类、作用
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统：限 制外源DNA，保护自身DNA，稳定细菌遗传性状。
(3)命名
EcoRⅠ
属 种 株 序 Escherichia coli RY13株
微生物基因工程制药
第一节 第二节 第三节 第四节
概述 基因工程基本技术与策略 基因药物生产的基本过程 基因工程药物制造实例
一、基因工程建立的基础
（一）、理论方面的三个重要的发现 1.生物遗传物质—DNA的发现
2. DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立
1953年，沃森(Watson） 和克里克 （Crick） 首次提出 了DNA双螺旋结构和半保留复制机理。这一重大发现大大 地促进了现代生物科学的发展。
（二）、基因工程的工具酶
克隆和进行基因操作需要对遗传物质进行剪切、修饰和连 接，这些过程都是在工具酶的催化下完成的。按功能将工 具酶分类，
可分为剪切酶类、 连接酶类和修饰酶类
如下所示
分子剪刀和分子针线
1.限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease, RE)
(1) 定义
是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链 DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶 或切割酶。
2.DNA克隆 在体外外来遗传物质与载体DNA结合成具自我复制的DNA分子， 通过转化或转染宿主细胞、筛选出转化子细胞，再扩增提取 获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。
3.目的基因 有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或 DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物--蛋白质。 4.基因载体 也称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现 外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻 译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆 载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。
具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA
⑶
以DNA为模板，催化合成cDNA双链。
逆转录酶的应用：
⑴ ⑵ ⑶ ⑷ ； 代替Klenow酶用于DNA序列分析； 制备杂交探针等。
1972年，美国斯坦福大学Berg研究小组利用限制性内切酶 EcoR I 和T4 DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组实验。
1973年，科恩（Cohen） 等人用EcoR I内切酶处理 大肠杆菌的抗四环素和抗 青霉素及磺胺的质粒，并 连接成一个新的重组质粒。 将这种工程化的质粒转入 大肠杆菌，在含有四环素 和青霉素的平板中筛选重 组菌落。 同年，加利福尼亚的博耶 （Boyer）也进行了类似 的实验。 重组子转化的成功标志着 基因工程的诞生。
G + GATCC CCTAG G
A +GATCT A TCTAG
2. DNA聚合酶Ⅰ （全酶）
E.Coli DNA聚合酶Ⅰ（DNA pol Ⅰ） 是一个具有 3 种酶活性的多功能性酶。 包括： 5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性
3.TaqDNA聚合酶
3.遗传信息传递方式的确立
（二）、技术上三个重要成果
1.基因工程的工具酶
1966年，发现DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜 血杆菌中分离并纯化限制性内切酶 Hind Ш，使DNA分子的 切割成为可能。1979年，Bltimore和Temin领导的两个研究 小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。