在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而
言。
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四、限制性核酸内切酶的作用
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有 回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基 和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切 割的特异性不同，结果有三种不同的情况：
DNA连接酶
连接两个DNA分子或片段
多核苷酸激酶
催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端 标记探针
末端转移酶
在3’末端加入同质多聚物尾
SI核酸酶，绿豆核 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变
酸酶
为平端
DNA端酶Ⅰ
降解DN完A整，版课在件双ppt 链DNA上产生随机切口23
第二节 重组DNA载体
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二、限制性核酸内切酶的命名
按酶的来源的属、种名而定，取属名 的第一个字母与种名的头两个字母组成的 三个斜体字母作略语表示；如有株名，再 加上一个字母，其后再按发现的先后写上 罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株 （Haemophilus influenzae d）中先后分离 到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、 HindⅡ和HindⅢ。
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基因工程属于生物技术范畴，广义的生物技术指任 何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物 品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技 术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。一般认 为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工 程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术 的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术 的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生 物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。 生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细 胞融合技术最为突出。蛋白质工程则是在基因工程 基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学 辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开 创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新 时期，被称为第二代基因工程。
①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以 Eoor 为例：
5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp OHTTAAC…3’
3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'… CTTAAOH pG…5'
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②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例：
5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp OHG…3’
Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白 质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别
序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要 ATP供给能量。
Ⅲ类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成，仅需
Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切
断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常
第九章 DNA重组技术
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对多数生物来说，基因本质是DNA，基 因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列 的重新组合和建造，所以基因工程的核 心就是人工的DNA重组（
重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才 有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。 纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克 隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。 所以DNA重组和分子克隆是与基因工程 密切不可分的，是基因工程技术的核心 和主要组成部分。重组DNA、分子克隆 甚至成了基因工程的代名词。
理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：
①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自 主复制能力。
②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。
③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主 细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的 限制性核酸内切酶位点。
④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组 操作。
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第一节 工具酶
一、限制性核酸内切酶的概念
核酸酶可分为两类：核酸外切酶是从核酸的一 端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切 酶则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸 链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并 将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异 的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切 断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲 基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基 化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异 的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细 胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身 的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信 息的稳定。
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三、限制性核酸内切酶的分类
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情 况不同，分为三类：
Ⅰ类限制性核酸内切酶 由3种不同亚基构成，兼具 有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识 别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点 以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类 酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。
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DNA重组技术中最常用的工具酶
酶
主要用途
限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链
DNA聚合酶Ⅰ 或 其大片段 （Klenow）
①缺口平移制作标记DNA探针 ②合成cDNA 的第二链 ③填补双链DNA3’凹端 ④DNA 序列分析
耐热DNA聚合酶 聚合酶链反应（PCR） （Taq DNA聚合酶
3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ 3’…GOH pACGTC…5
③产生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ为例：
5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGp OHCGA…3’
3’…AGC↑GCT…5’Nru Ⅰ3’…AGCOh pGCT…5’
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⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或 携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分 离出来。这才介于克隆操作。