工作流程
五.测序 携带DNA的捕获磁珠（20um）随后放入 PTP板（Pico TiterPlate）的微孔（29um）中 Pico TiterPlate） 进行后继的测序反应。此反应释放出的光信号 实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有 一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一 分子的光信号。由此一一对应，就可以准确、 快速地确定待测模板的碱基序列。
工作流程
六.数据分析 454测序系统可以在10小时的运行当中获 得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信 息。并提供两种不同的生物信息学工具对测序 数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。
454测序系统图示 454测序系统图示
A为液体试剂供应装置 B为反应池 C为光线检测成像系统和计算机 控制系统
工作流程
三一个磁珠携带样就形成了只包 含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
工作流程
四.乳液PCR扩增 每个独特的片段在自己的微反应器里进行 独立的扩增，而没有其他增后产生了几百万个 相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增 的片段仍然结合在磁珠上。
测序原理
经乳液PCR法扩增后携带有大量模板的磁珠被 放置到芯片上的微孔中。随后使用焦磷酸法测序， 每一轮反应都会掺入一个核苷酸，同时释放一个焦 磷酸，然后焦磷酸和腺苷酰硫酸在磷酸化酶的催化 下生成ATP，然后荧光素酶就可以在ATP参与下将 荧光素转化为氧化荧光素，同时发出荧光被检测器 检测到。
工流程
新一代测序技术
—— 454基因组测序技术
报告人：钱龙 组员：郭斌 邓娟 梁敏 高婷婷 专业：生物化学与分子生物学
背景介绍
DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程，它已广泛应 用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通 量DNA测序技术予以解决。 迄今为止，我们获得的绝大部分DNA序列都是基于 Sanger测序法获得的。但在过去几年，大规模平行测序平台 （massively parallel DNA sequencing platform massively platform）已经发展为 主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降 到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测 序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。目前，新的测序技 术及手段还在不断涌现，比如最新的进展就包括建立序列数据 库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。 新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全 面、更深入地分析基因组、转录组及蛋片制备
焦磷酸测序
加入含酶小微珠
工作流程
一.样品输入并片段化 大的样品例如基因组DNA或者BAC等被 打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非 编码RNA或者PCR扩增产物，这一步A 和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测 序步骤。具枪Sanger 测序法策略
图b为鸟枪循环芯片测序法 策略
测序原理
在体外构建好的两端带接头的单链DNA在 一个油包水的乳液环境中进行PCR扩增，因为起始 阶段模板浓度非常低，因此，大部分包还有磁珠的 为乳液滴都只含有一种模板，经PCR扩增后，每个 磁珠只连有一种模板的扩增产物，然后打破为乳液 滴，收集磁珠，加入芯片中。
测序策略
454基因组测序使用了一种新的测序策略——循 环芯片测序法（cyclic-array sequencing），也可将 其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。 所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA DNA 样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应（模板 变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反 应。 与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作 更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广 泛的应用。
测序质量
454测序技术的准确率在99%以上。其主 要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺 入，如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻 止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要 从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生 误差。因此，454测序平台的主要错误类型是 插入-缺失。
总结
454测序结果的数据质量高，且分析简单 。其多种多样的应用彰显出它强大的能力，那 些传统意义上无法用测序来解决的问题现在也 可以一并解决了。超长读长与易用的分析工具 相结合，让研究人员能更集中精力于科学研究 ，而不是研究测序过程中的某个技术细节。这 样研究项目能快速完成，接着踏上新的研究道 路。
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