胰凝乳蛋白酶 溶菌酶 木瓜蛋白酶 碳酸酐酶
Ser195 Asp102 His57
Asp129 Glu35
Cys25 His159 His93- Zn – His95
| His117
（二）活性中心的研究方法
1．X—衍射 研究蛋白质结构 X—射线撞击原子中电子后,产生衍射
图,分析结构——空间结构
胱氨酸 赖氨酸
清华大学学术专著
蛋白质化学修饰
周海梦 王洪睿 编著 清华大学出版社，1998
3．动力学分析
酶蛋白——两性电解质——pH改变 基团解离状 态改变 导致酶活性变化 根据pH变化——研究pH和活性的关系 提供某 些基团pK 推断基团的作用 参数Vmax,Km与pH关系 解离基团
需供助其它方法，进行推断
肽段
分离P32 肽段→测一级结构
（3）亲和标记法
利用酶对S的特殊亲和力，将酶加以标记— —亲和标记。
Y Y
X
Y
Y X-Y
Y
亲和修饰剂： ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基
亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残 基亲和力小。 ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。
③不同部分的相同基团，修饰效果不同， 分子内部的必需基团，不易被修饰。
活性中心基团的鉴定标准
①失活程度与一定修饰剂浓度成一定比例
关系
②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。
先加S或竞Ⅰ 加共价修饰剂 去S或竞Ⅰ 活性不丧失
透析除
（2）差别修饰法（差别标记）
过量S 或 竞Ⅰ下加修饰剂 去除多余修饰剂及S 同位素修饰作用 则原来被保护基团带有同位素标记
X-射线衍射技术：用于蛋白质及核酸三维结构的确 定，至今已有数百种蛋白质的结构被确定，分辨率 为A的量级，但蛋白质结晶难度大
X-Ray Diffraction
2．化学修饰法
应用最早、最广泛——鉴定酶活中心
原理：酶分子上的侧链基团，被化 学试剂修饰后若活力下降或丧失——则 为必需基团。
（1）专一性氨基酸共价修饰法
某些试剂能与氨基酸残基的侧链基团反 应——引起共价结合、氧化、还原等，
使基团的结构和性质发生改变，视失活程 度，查找必需基团。
如①-NH2
试剂 ：乙酸酐 2，4—二硝基氟苯（DNFB） 异硫氰酸苯酯（PITC）
E-NH2 +
-N=C=S
S E - NH - C - NH-
②Ser-OH DIFP(二异丙基氟磷酸)
（贡献残基） structure residues 4.非贡献残基non-contributing residues
Common Features of the Active Sites
Active site
The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.
DFP对 胰凝乳蛋白酶——S（Phe，Trp，Tyr） 胰蛋白酶——S（Lys Arg）都抑制，
而亲和试剂则能分开。
例：胰凝乳蛋白酶
S为芳香族氨基酸—aa（其它物质）形
成的肽键
↑
肽键
酯键
O
CH2 CH C NH
O=S=O
OH
酰胺 乙酯
NH2 O-CH2-CH3
甲苯磺酰苯丙酰胺 为最佳 S
甲苯磺酰苯丙酸乙酯
如NaBH4）
His
二乙基碳酸丁二酮
Tyr
四硝基甲烷，N-乙酰咪唑，碘
Trp
N-溴代琥珀酰亚胺
Asp（Glu）水溶性羰二亚胺
但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的
②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失 活， 因此不一定是活性中心基团被共价 修饰
第二节 酶的结构与功能
①酶催化作用的结构基础 ②酶催化作用的机制
一、活性中心（active site）
（一）活性中心的概念
酶分子中各种残基的作用
1960年Koshland将酶分子氨基酸残基或其 侧链基团分为四类。
1.接触残基 contact residues 2.辅助残基 auxiliary residues 3.结构残基 contributing residues
CH 3
TPCK（甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮）
O
CH2 CH C CH2 Cl
NH O=S=O
亲和试剂 用甲苯磺酰－L－苯丙氨酸为基本
结构，将羧基换成氯甲基酮—活
泼烷化剂
CH3
表 一些酶的亲和试剂
酶 胰凝乳蛋白酶
胰蛋白酶
亲和试剂 被修饰的残基
TPCK TLCK
His Ser195 His
天冬氨酸转氨酶 β-溴丙酮酸 β-氯丙氯酸
表 重要基团的非特异共价修饰试剂
被修饰的基团 氨基
Lys or N-末端aa
试剂 乙酸酐 顺丁烯二酸 亚硝酸 DNFB
PITC
胍基 Arg
羧基 Asp Glu
丙二醛
cyclohexanedione 环己二酮
Phenylglyoxal 苯甲酰甲醛
硫化二亚胺
对溴苯酰甲基溴
咪唑基 His
酚基 Tyr
DIFP — P, P32 — 差别
酶蛋白 保护剂（S 或竞Ⅰ）
保护活性中心aa残基（Ser-OH） 加DIFP（非标记）
结合活性中心以外的Ser—OH 去除DIFP 去除保护剂 加DIFP32
置换活性中心保护剂，活性中心被标记（P32）
含有P32 的活性中心的酶蛋白
完全水解
部分水解
鉴定aa- P32
溴丙酮 碘乙酸 二硝基氟苯
碘重N化合物 四硝基甲烷
吲哚基 Trp 二硫键
巯基 Cys
2-羟 — 5-硝基溴苯
乙硫醇 二硫赤藓醇 碘乙酸（酰胺）二酰亚胺 N-乙基顺丁烯
表 各种氨基酸侧链的修饰剂
Cys
汞化物，如对-氯汞苯甲酸；二硫化物，
如5，5-二硫双（2-硝基苯甲酸）；碘
乙酰胺
Lys
三硝基苯磺酸，吡哆醛磷酸（还原剂，
实际上化学修饰法也需动力学分析判断结果