木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰
通过动力学实验证实，还有一个组氨酸残基的 咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化部位（木瓜 蛋白酶共有212个氨基酸，有His81和His159两个 His）。Husain和Lowe用1,3-二溴丙酮修饰木瓜蛋白 酶，在pH5.6，1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白 酶的活性。对修饰后的酶进行氨基酸分析，发现少 一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮（2-14C）的修饰实验 中，发现修饰剂连接了Cys-25和His-159两个残基， 因此知道了这两个基团之间的距离在 5 以内。这个 结论通过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。
酶的活性中心示意图
A、B、C 为活性中心的必需基团
酶分子中氨基酸残基的分类
1960年，Koshland将酶分子中的氨基酸残基或 其侧链基团分成4类：接触残基（直接与底物接触， 参与结合或催化的残基），辅助残基（对接触残基 的功能起辅助作用的残基，也位于活性中心），结 构残基（维持构象的残基，此为活性中心以外的必 需基团），非贡献残基（或称非必需残基，非必需 只是对酶发挥活性而言，它们可能有其他作用，如 识别自身物质、运输、防止降解等）。
酶活性部位微环境的影响
由于酶活性部位微环境的影响，活性中心的基 团对某一非特异性试剂的反应性可能会比活性中心 以外的基团的反应性高或低。如3-磷酸甘油醛脱氢 酶的活性中心的Ser能优先地被14C-碘乙酸标记； 牛胰核糖核酸酶活性中心的His能优先地被碘乙酸 标记，其Lys-41的ε－NH2可优先地被氟二硝基苯标 记。也有些酶活性中心的基团对某种非特异性试剂 的反应性很低。
胰蛋白酶的差示标记
Eyl和Inagami的实验证明了上述推测。他们用 苯甲脒（benzamidine，C6H5C(=NH)NH2）作为β胰 蛋白酶的竞争性抑制剂，以1-乙基-3-二甲氨丙基碳 二亚胺为缩合剂（1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide，C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2），以 甘氨酰胺（glycine amide）为修饰剂，以差示标记法 证明了Asp177是结合底物的一个基团。酶的羧基与 甘氨酰胺以酰胺键结合后几乎完全抑制了酶水解Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯（N-α-benzoyl-Larginine ethyl ester）的能力。
各种类型残基举例
接触残基： R1、R基： R3、R5、R7
辅助残基： R4
结构残基 ： R10、R162、 R169
2．酶活性中心的拓扑学
酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条 沟槽，形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不 同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的 某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基 团靠近。亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与 疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残 基亲合。
（1） 使用非特异性试剂 对特殊基团的标记
非特异性试剂可以修饰特定的某种基团， 但不能区分活性中心内部和外部的基团。如果 某种基团只存在于活性中心，而其他部位没有， 就可以用非特异性试剂修饰。
木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰
木瓜蛋白酶（papain）分子中有7个半胱氨酸残 基，其中的6个形成3对二硫键，只有一个以自由巯基 的形式存在于活性中心（Cys22-63，Cys56-95， Cys153-200，自由Cys25；编号从N端开始往C端进 行）。在这种情况下就可以用任何一种硫氢基试剂来 修饰，如用碘乙酸修饰。碘乙酸对木瓜蛋白酶的活性 中心无任何特殊亲和力，但由于这种特殊情况，仍然 得到了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结果。
羧肽酶A活性中心的结构
羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。 当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨基酸时 （苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反 应速度很快。但是当有这些较大疏水基团的氨基 酸残基进入亚位点3～6时，就会减低酶对这些底 物的亲和力。说明羧肽酶A对底物的识别和结合 有多个位点。同时，苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争 性抑制剂。
差示标记法
胰蛋白酶的差示标记
胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水 解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性基团 存在。ψ胰蛋白酶（Lys6-Ile7之间断裂成为β胰蛋 白酶；Lys6-Ile7和Lys131-Ser132两处断裂成为α 胰蛋白酶；Lys6-Ile7、Lys131-Ser132和Lys176Asp177三处断裂成为ψ胰蛋白酶）失去了水解碱 性氨基酸的羧基形成的肽键的能力，而保留了一般 的酯酶活性，估计Asp177的β－COOH可能与结 合底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。
羧肽酶A活性中心 的结构示意图
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二、酶活性中心化学基团 的鉴定
常用的方法有:
化学修饰法 反应动力学法 x-光晶体衍射法
1.化学修饰法
酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可 以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、 羧基等。如果一个基团是必需的，则被修饰后 酶活性会大大下降，甚至完全失活。
要充分利用高反应性的情况。
（2）差示标记法
这种方法是非特异性试剂标记法的一个发 展。它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性 中心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的 基团，然后透析除去保护剂（即竞争性抑制剂 或底物），再用同位素标记的非特异性试剂修 饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基 团位于活性中心。
第六章 酶的结构和功能
一、酶的活性中心 二、酶活性中心化学基团的鉴定 三、组成酶活性中心的重要化学基团 四、酶促化学修饰和酶活性调节 五、酶的空间结构与功能的关系 六、酶催化作用的机制 七、羧肽酶A催化作用的机制
一、酶的活性中心
1．酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催 化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可以在肽 链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘 旋，使它们在空间上接近，形成活性中心（或称活 性部位）。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结 合底物的任务，有些执行催化反应的任务。我们把 组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持 整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。