六、荧光显微镜检查方法 1.荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤
片系统(包括激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的 光激发标本发射荧光。
(1)光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。 对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发， 经过5～15min，球内气压升至50～70标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。
罗丹明 四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
德克萨斯红：荧光抗体观察
Hale Waihona Puke 2.标本制作要求 (1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间 (2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右 (3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充 分激分。
(4)封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮， 不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。
荧光信号增强封片剂
mowiol 40-88
4.8g
甘油
12ml
蒸馏水
12ml
0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml
上述混合（加热溶解），5000g离心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-[2,2,2]octane(DABcos)，终浓度2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于-20℃中。 (5)镜油
操作流程 (1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗 3×3min。 (2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h，或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
(3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30min，PBS洗3×3min。 (4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min。 (5)封片，镜检。
一部分荧光经过物镜，长通分色反射镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦点外，经 过焦点处的针孔，由检测器接收并转变成电信号。
3.光信号接收和成像方式 (1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：①由光电倍增管（PMT）把光信 号转变成电信号；②利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。
(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保 存。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧光，分子量580， RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的 氨基结合。
(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯 (5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS） (6)得克萨斯红（Texas red） (7)藻红蛋白（PE） (8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）
3.使用荧光显微镜注意事项 (1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。 (2)应在暗室中进行检查。 (3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。 (4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。
(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必 须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。
(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥 显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
激励法 U V BV
B
IB G
IG
分光镜 DM400 DM455 DM455
(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。
2.荧光素的种类 (1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量390D，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光 谱为520～530nm。呈现明亮的黄绿色荧光，分子量389.4。
(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱 为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。
DM500
DM505 DM570
DM565 DM600
激发滤光片 BP330-385 BP360-370 BP400-410 BP400-440 BP420-440
BP450-480 BP470-490 BP420-480 PB460-490 BP470-490 BP510-550 BP530-550 BP480-550 BP520-550 BP545-580
三、荧光素标记抗体的方法 (一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法 (1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸ε -氨基与FITC上 硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ ‖ S HH
(2)成像方式 ①载物台运动成像：以直径很小的激光束照射样品，照射点发出的荧光信号经 PMT变成电信号，然后载物台移动到下一点，记录该点的荧光强度。该方法无轴向像差，成 像时间长；
②反射扫描成像方式，通过转动反射镜使激光连续照射样品，由CCD摄像机记录下照射点 所发射的荧光，成像速度快。
4.参数的选择 基本参数：Confocal,pinhole,detector,
射荧光。
1、具备用于标记抗体的荧光素条件 (1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其 降解产物易排除。
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。
(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。
(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。
截止滤光片 BA420 BA455 BA475
BA515
BA515IF BA590
BA580IF BA610IF
用途 自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体 儿茶酚胺观察 芥子喹吖因；染色体 硫磺素S：淋巴细胞 吖淀黄素：核酸 异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察 吖啶橙：DNA，RNA 金胺结核杆菌
(6)标本染色后应立即观察。 (7)荧光高度的判断标准，分四级“ －”为阴性，“ ＋”为仅能见明确可见的荧光； “ ＋＋”为可见有明亮的荧光；“ ＋＋＋”为可见耀眼的荧光。
七、非特异性染色的消除方法 根据产生的原因采取适当的方法，常用方法：
1.动物脏器粉末吸收法 2.透析法 3.Sephadex G-50柱层析法 4.DEAE纤维素柱层析法 5.荧光抗体稀释法 6.纯化抗原方法 7.纯化抗体方法 8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝
发射 以辐身方式跃迁时，能量转化成相 应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐身方 式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发 射光，叫荧光。
二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发
1.仪器构成 (1)计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。 (2)激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。
(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。 (4)检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。 (5)X－Y平台 (6)Z-轴步进马达
2.共聚焦成像原理
激光器发出的激光束经过光的扩束和整形，变成一束直径较大的平行光束，长 通分色光镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在 激光的激发下发出沿各个方向的荧光，
免疫组化技术
主要内容 一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜 七、非特异性荧光的消除方法
八、激光扫描共聚焦显微镜
思考题： 1.什么叫荧光？ 2.常用荧光素有哪些特征？ 3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备方法？
4.免疫荧光组化直接法、间接法的 原理和主要操作流程？
5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？ 6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？
一、荧光的特征 分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一
系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并 伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。
激发 当电子吸收能量跃迁到较高能级， 这个过程叫激发。
FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖
H SH
(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1
抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总 量的1/10。
荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01mgFITC/1mg抗体。
结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体 溶液中。
透析 过柱 Sephade×G50或 G25 保存 4℃ -40℃等量甘油分装保存。 2.Chadwick法 3.改良法 4.透析标记法 （二）四乙基罗达明标记抗体方法 （三）藻红蛋白标记抗体方法
实习1 免疫荧光组化----间接法 1.4 µ m石蜡切，58℃烤，18h。 2.常规脱蜡至水（二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10min，无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇，75％乙醇 各2min）。 3.PBS洗（磷酸盐缓冲液0.01mol/L pH7.4）3×3min。
4.0.1%胰蛋白酶（100ml蒸馏水中加入100mg胰蛋白酶，100mg氯化钙，用0.1N NaoH调pH至 7.6），37℃，消化30min。 5.0.01mol/L pH7.4 PBS洗3×3min。 6.兔抗人AFP1:50（用专用抗体稀释液稀释）37℃，1h或室温4h，或4℃过夜。