小鼠脾细胞/胸腺细胞BD Phosflow™ 操作流程Protocol I (Detergent Method)所需试剂：试剂准备：按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。
使用前37°C 预热15-30分钟。
按照说明书用双蒸水稀释制备1 x Perm/Wash Buffer I （货号：557885）。
放置至室温后使用。
操作步骤：1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用PBS或完全培养基制备单细胞悬液2. 350g 离心6- 8 分钟，弃上清3. 混匀细胞（此步动作需要轻柔）4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。
必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。
5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要在前处理完成后，可以在完全培养基中静息2-4小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。
6. 用适当的刺激剂处理细胞，37°C 孵育适当的时间（1到30分钟，参见操作说明）。
实验需设立未处理样本为阴性对照。
7. 刺激处理完毕后，迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。
振荡器低速振荡混匀5-10次。
8. 37°C 孵育10-12分钟。
9. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
10. 振荡器低速振荡混匀细胞。
11. 细胞清洗：a．加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer试剂（货号：554656）。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞。
12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞，但此步骤不得超过2次。
13. 于1–10 x 10^6细胞中加入1ml （最少1ml）Perm/Wash Buffer I进行细胞破膜。
轻柔混匀后，室温孵育15-30分钟。
14. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
15．振荡器低速振荡混匀细胞。
16. 细胞清洗：a．加入与1ml Perm/Wash Buffer I。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞17. 用Perm/Wash Buffer I重悬细胞，使细胞终浓度为5–10 x 106 cells/mL。
18. （选做步骤）每1 x 10^6细胞中加入0.06 μg Fc 封闭抗体（货号：553141 or 553142）。
混匀后冰浴15分钟。
19. 取100 μL 细胞悬液（0.5–1 x 10^6细胞）置于12 x 75-mm BD Falcon™试管中，参考抗体说明书推荐用量加入相应BD Phosflow抗体。
20. 混匀后室温避光孵育60分钟。
21. 细胞清洗：a．加入至少3ml Perm/Wash Buffer I。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞。
22．加入约500 μL的Perm/Wash Buffer I重悬细胞，混匀后上机检测。
Protocol II and III (Mild or Harsh Alcohol Method)**根据所用的表面标记抗体和特异性磷酸化蛋白抗体选择使用Perm Buffer II或者Perm Buffer III 。
更多信息请详见如下链接：Tested Surface Markers及BD FACSelect™ Buffer Compatibility Resource .所需试剂：试剂准备：按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。
使用前37°C 预热15-30分钟。
Perm Buffer II（货号：558052）或 III（558050）用前需置于-20°C-4°C预冷。
操作步骤：1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用PBS或完全培养基制成单细胞悬液2. 350g 离心6- 8 分钟，弃上清3.混匀细胞（此步动作需要轻柔）4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。
必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。
5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要在前处理完成后，在完全培养基中静息2-4小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。
6. 用适当的刺激剂处理细胞，37°C 孵育适当的时间（1到30分钟，参见操作说明）。
实验需设立未处理样本为阴性对照。
7.刺激处理完毕后，迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。
振荡器低速振荡混匀5-10次。
8. 37°C 孵育10-12分钟。
9. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
10. 振荡器低速振荡混匀细胞。
11.细胞清洗：a．加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer（货号：554656）。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡。
12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞，但此步骤不得超过2次。
13．于1–10 x 10^6细胞中加入1ml （最少1ml）预冷的Perm Buffer II或 II进行细胞破膜。
振荡器低速振荡，冰浴30分钟。
14. 清洗细胞：a. 加入至少3ml Stain Buffer重悬细胞（对应每1ml Perm Buffer）。
b. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c. 振荡器低速振荡混匀细胞。
15. 重复清洗细胞2次：a. 加入与步骤9中相等量的Stain Buffer。
b. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c. 振荡器低速振荡混匀细胞。
d.重复步骤a-c。
16. 将细胞重悬于Stain Buffer，使细胞终浓度为5–10 x 10^6 cells/mL。
17. （选做步骤）每1 x 10^6细胞中加入0.06 μg Fc 封闭抗体（货号：553141 or 553142）。
混匀后冰浴15分钟。
18.取100 μL 细胞悬液（0.5–1 x 10^6细胞）置于12 x 75-mm BD Falcon™试管中，参考抗体说明书推荐用量加入相应BD Phosflow抗体。
19. 混匀后室温避光孵育60分钟。
20. 细胞清洗：a．加入至少3ml Stain Buffer。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞。
21．加入约500 μL的Stain Buffer重悬细胞，混匀后上机检测。
Protocol IV (Harsh Detergent Method)所需试剂：试剂准备：按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。
使用前37°C 预热15-30分钟。
按照说明书用1X PBS稀释制备1X 或 0.5X Perm Buffer IV （货号：560746）。
使用前置于室温。
根据操作说明及如下链接BD FACSelect™ Buffer Compatibility Resource 选择使用1X 或 0.5X Perm Buffer IV。
因Perm Buffer IV破膜能力最强，针对Perm Buffer IV的操作过程中，有Perm Buffer IV存在情况下的振荡、混匀动作必须轻柔，以防细胞破碎。
操作步骤：1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用PBS或完全培养基制备单细胞悬液2. 350g 离心6- 8 分钟，弃上清3. 混匀细胞（此步动作需要轻柔）4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。
必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。
5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要在前处理完成后，在完全培养基中静息2-4小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。
6. 用适当的刺激剂处理细胞，37°C 孵育适当的时间（1到30分钟，参见操作说明）。
实验需设立未处理样本为阴性对照。
7. 刺激处理后，迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。
振荡器低速振荡混匀5-10次。
8. 37°C 孵育10-12分钟。
9. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
10. 振荡器低速振荡混匀细胞。
11.细胞清洗：a．加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer（货号：554656）。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞。
12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞，但此步骤不得超过2次13. 向0.5–2.0 x 10^6细胞中缓慢、滴加1ml （最少1ml）预冷的Perm Buffer IV进行细胞破膜。
振荡器低速振荡混匀细胞，室温孵育15-20分钟。
14. 600g 离心6-8分钟，弃上清，将流式管倒置在吸水纸上，吸去多余液体，试管中残余液体量不多于50μL 。
15. 振荡器低速振荡混匀细胞。
16. 清洗细胞2次：a. 加入至少3ml Stain Buffer。
b. 600g 离心6-8分钟，弃上清，将流式管倒置在吸水纸上，吸去多余液体，试管中残余液体量不多于50μL。
c. 振荡器低速振荡。
d.重复步骤a-c。
17. 将细胞重悬于Stain Buffer，使细胞终浓度为5–10 x 10^6 cells/mL。
18.（选做步骤）每1 x 10^6细胞中加入0.06 μg Fc 封闭抗体（货号：553141 or 553142）。
混匀后冰浴15分钟。
19. 取100 μL 细胞悬液（0.5–1 x 10^6细胞）置于12 x 75-mm BD Falcon™试管中，参考抗体说明书推荐用量加入相应BD Phosflow抗体。
20. 混匀后室温避光孵育60分钟。
21. 细胞清洗：a．加入至少3ml Stain Buffer。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。