小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
陈素君
200900140007
实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。
学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制
及酸碱度的调节。
初步掌握无菌操作方法。
学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。
实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。
因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。
细胞培养分为原代培养和传代培养。
原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。
要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。
细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。
细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。
实验用品：
一、器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。
上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好
倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板
二、试剂
PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝
三、小白鼠
实验方法：
1. 细胞的原代培养
1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。
1.2在超净工作台无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。
沿
开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。
提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。
PBS缓冲液清洗1-2次待用。
1.3在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴，用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏，用针
头在脾脏上戳几个小孔，顺脾脏轻轻刮，从小孔挤出分散的细胞。
1.4将培养皿倾斜，使大块组织充分沉淀，吸取分散的细胞悬液2mL，1000r/min离心5min。
1.5取塑料培养皿一个，用“枪（1mL）”加入细胞培养液2mL，在盖上加标记后待用。
用“枪
（200μL）”吸取塑料皿中的培养液400μL，加入离心后并弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹散并混匀细胞，然后吸取200μL接种于上述塑料培养皿中，混匀，放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
2. 原代细胞观察、死活鉴定及计数
2.1取出培养物，观察培养液的颜色。
然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况。
2.2取0.5mL细胞悬浊液于试管中，加1-2滴台盘蓝染液混合均匀，染色2min。
2.3将细胞悬液滴在计数器两边V字形槽内。
细胞悬液依毛细作用扩散到计数区。
在镜下计数。
取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格内死活细胞的数量。
（注意：当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。
）先计数总细胞，再计数死细胞（蓝色）。
计算细胞死亡率。
实验结果：
1.细胞原代培养形态观察
原代培养后的培养皿呈粉红色，未出现异味，未被污染。
在倒置相差显微镜下观察可看到聚集生长的细胞，形态不明显。
计数时观察到游离的活细胞膜完整，形态多为近圆形，细胞质均匀。
活细胞浓度（个/mL）=（20+18+11+17) /4*10000*1=1.65*106
活细胞浓度（个/mL）=（11+10+5+10）/4*10000*1=9.00*104
活细胞率=活细胞浓度/活细胞浓度*100%=54.54%
分析与总结：
1、取小鼠脾时注意保持其完整，注入缓冲液要慢而准且适量，不要撑破脾脏，保证细胞分散
游离出来。
2、培养液PH为7.0~7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培养液
的颜色改变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况。
3、生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞
衰老。
除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。
游离期细胞一般圆形，折光率高，而衰退期细胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易区分。
4、倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察。