植物病毒分子检测方法概述邵碧英(福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。
CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。
广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。
1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。
血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。
111 酶联免疫吸附反应(EL ISA)EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。
酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。
该方法已被用于各种植物病毒检测。
后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。
几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。
EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。
112 斑点免疫吸附法20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。
也已用于各种病毒检测。
斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。
113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。
改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。
鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。
徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。
把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。
组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。
但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。
114 电印迹免疫分析(EBLA)电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。
EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。
此方法—773—不适于大量样品的检测。
115 伏安酶联免疫分析法伏安酶联免疫分析是将酶催化、免疫技术和伏安法检测相结合的一种免疫分析方法。
焦奎等[4]已研究10个伏安酶联免疫分析新体系,灵敏度均高于EL ISA 。
伏安酶联免疫分析法具备了伏安法的高灵敏度和高准确性,又具备免疫反应的特异性,仪器设备简单,操作方便。
但此方法不适宜于大量样品的分析。
116 胶体金免疫法胶体金颗粒具有高电子密度和能结合生物大分子的特性,将其标记到抗体或SPA 上,再利用抗原抗体反应来检测抗原,增强了可见性,若在金颗粒周围再进行银染色又提高了检测灵敏度。
在膜上进行免疫金、免疫金/银染色时分别称为斑点免疫金(Dot 2IGS )和斑点免疫金/银(Dot 2IGSS )染色。
魏梅生[5]将Dot 2IGS 和Dot 2IGSS 应用于烟草环斑病毒(Tobaccoring 2spot virus )的检测,还将胶体金颗粒标记TRSV 的抗体,制成了免疫层析检测试条[6],试纸条检测操作简便,不需要任何仪器,10mim 之内即有结果,特别适于田间快速诊断和口岸检疫。
117 免疫PCR 新近发展起来的免疫PCR 是将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高录敏度有机结合的检测技术与酶标检测技术相比,免疫PCR 是用DNA 片段取代酶来标记抗体,然后用PCR 扩增DNA 片段从而放大抗原抗体反应,大大提高了检测灵敏度。
Sharman [7]建立一种复合免疫PCR ,可同时检测香蕉和车前草粗提取汁液中的香蕉苞叶花叶病毒(Banana bract mosaic virus ,黄瓜花叶病毒和香蕉束顶病毒(Banana bumchy top virus )。
2 以病毒核酸为基础的检测方法血清学方法检测植物病毒的优点是灵敏、使用方便,与生物学实验相比节省空间、时间,并且可重复性强,在病毒检测技术方面是一大进步。
但在样品量极少或病毒在组织中含量很低、无蛋白外壳的类病毒的检测时,必须用核酸检测法。
211 PCRPCR 是一种DNA 体外扩增技术,大多数植物病毒含的是RNA ,首先要将RNA 反转录成cDNA ,后进行PCR ,此方法称为R T 2PCR 。
近年来,在R T 2RCR 基础上已经发展了多种方法用于植物病毒的检测。
复合R T 2PCR 是在同一R T 2PCR 反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段。
Nassuth 等[8]应用复合R T 2PCR 同时检测葡萄藤提取物中的4种病毒。
Nie 等[9]也应用复合R T 2PCR 技术同时检测了马铃薯的5种病毒和1种类病毒。
复合R T 2PCR 和用单一R T 2PCR 做相同数目的病毒检测相比,节约了时间和试剂。
PCR 2EL ISA 是用EL ISA 替代琼脂糖凝胶电泳来检测PCR 产物的方法,录敏度高。
Olmos 等[10]用PCR 2EL ISA 方法检测PPV ,灵敏度比免疫PCR 高100倍。
采用将PCR 和荧光测定相结合的实时荧光定量PCR 不仅可避免假阳性的出现,而且提高了检测灵敏度,还能进行定量检测。
Roberts 等[11]用实荧光定量R T 2PCR 可检测少至500fg 的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus.)。
Eun 等[12]采用复合荧光定量R T 2PCR 法可同时检测少至5fg 的CymMV 和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot to 2bamovirus )。
PCR 对病毒是的有利条件是它特别灵敏,可检测最低病毒含量达到fg 水平,可直接对任何材料,包括坏死、鲜活、甚至很微量材料进行检测。
但植物病毒多为RNA 病毒,RNA 很容易降解,撮相对困难,只有那些已知序列的病毒才能作PCR ,实验时需要昂贵的试剂和特殊的设备。
—873—核酸探针和固定在膜上的核酸进行杂交,使杂交体带上标记而被是出来。
一般采用核酸点杂交法来检测植物病毒。
朱水芳等、李尉民等[13～14]分别应用核酸杂交成功检测了ToRSV、SBMV。
核酸杂交还可和R T2PCR 结合使用。
Bertolini等[15]采用复合R T2PCR 同时检测能侵染橄榄树的6种RNA病毒,后用这6种病毒的特异Dig标记的探针对PCR产物进行检测。
核酸分子杂交法特异性强,灵敏度高,可检测到lpg的DNA,可检测大量样品。
213 其它核酸检测法RNA病毒、类病毒在寄主体内存在的特异dsRNA有各自的迁移率、分子量、片段数,可用于植物病毒的鉴定,dsRNA分析技术[16]就是以此为检测依据的。
基因芯片是近10年发展起来的应用于分子生物学研究的一项新技术,在核酸序列测定、基因突变的检测、基因表达情况的分析等诸多领域的研究中得到了广泛应用。
国内外学者也正致力于植物病毒检测的基因芯片的研究和开发,相信不久的将来基因芯片会在快速、灵敏地检测大批量样品的植物病毒上发挥重要作用。
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