2013-8-9
16

②补钉延长法：根据目的基因两条互补链全 序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片 段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
2013-8-9
17

大片段酶促法：根据目的基因的全序列，分别合 成40-50碱基长的单链DNA片段。
2013-8-9
18
2013-8-9
19
⑶DNA化学合成的用途

2013-8-9
8
㈡直接分离法
⑴限制性核酸内切酶酶切分离法：
①对已知序列的DNA分子，只需用已知识别序列的 限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化 所需DNA片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可 得到目的基因的克隆。
2013-8-9
9

②对已知定位的目的基因，只要根据目的基因 两侧的已知的限制性核酸内切酶识别位点，用 适当的限制性核酸内切酶切割，一次就可获得 目的基因。
磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法；具体
操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。
前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中 间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固 相亚磷酰胺法原理设计的。
2013-8-9
13
2013-8-9
15

⑴化学合成目的基因的前提条件是基因DNA序列已 知 ⑵化学合成的三种策略 ①小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合成 12-15碱基长的单链DNA小片段。
合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、 胰岛素基因、干扰素基因等 合成探针 合成引物 合成连接子和接头 修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基 因、尿激酶原基因等 设计新型基因

2013-8-9
20
㈣逆转录法

酶促逆转录主要用于合成分子质量较大，转 录产物mRNA易分离的目的基因。这种方法以 目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶的作用 下合成互补的DNA，即cDNA，然后在DNA聚合 酶的催化下合成双链cDNA片段，与适当的载 体重组后转入受体菌扩增，获得目的基因的 cDNA克隆。

2013-8-9
27
本章重点掌握的内容
目的基因的概念及用途 制备目的基因常用的方法 鸟枪法的概念、用鸟枪法制备目的基因的 主要步骤、优点与缺点 DNA化学合成的方法及其用途

2013-8-9
28

如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱 法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用 基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
2013-8-9 7
③重组DNA分子导入受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性 酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受 体细胞；如果转化子采用基因产物功能检 测法筛选，则选择能使目的基因表达的受 体细胞 ④筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法 （筛选模型的建立）
第五章 目的基因的制备
一、目的基因的概念 二、获得目的基因的方法
三、目的基因用途
2013-8-9
1
一、目的基因的概念

外源基因:插入到载体上并导入到宿主细胞内 的特定基因或DNA片段，称为外源基因。 目的基因：通常将那些已被或者准备要被分 离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段，称为目的基因。

物理化学法分离目的基因的方法主要有密度梯度 离心法、单链酶解法和分子杂交法等。
2013-8-9 11
㈢基因的化学合成

化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核
苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一
个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、
分离、去保护五大操作单元。
201讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、

2013-8-9
2

目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸 如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、 毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。随 着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有 用的基因。它是大自然恩赐于人类的宝贵资源， 等待人们去开发利用。
2013-8-9
3
二、获得目的基因的方法
直接分离法 逆转录法 聚合酶链式反应法(PCRA差异显示法

2013-8-9
4
㈠鸟枪法
鸟枪法：是将基因组全部打乱,切成碎片,进行随机 测序,测序后再将它们拼接起来，进而获得目的基 因的方法。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆 分离。
2013-8-9
5

鸟枪法的优点： 速度快，简单易行，成本较低，并能获得与天然 基因组DNA一亲的有内含子的基因DNA片段。 鸟枪法克隆目的基因的缺点 补平基因缺口困难 排序拼装麻烦，工作量较大 专一性较差 需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构

③即使含目的基因的DNA分子未定序或无定位， 也只须先通过酶切分析，随后再通过8-9
10
⑵基因分离的物理化学法

这是基因工程在发展初期所用的方法，某些生物 的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的。 基本原理是DNA分子的两条链存在着G≡C、A=T碱 基配对,其中GC间存在3个氢键，AT间存在2个氢 键。不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化 性质，如浮力密度和解链温度等也有明显不同， 采用适当方法可从基因组分离出目的基因。



2013-8-9
6


鸟枪法制备目的基因的主要步骤
①染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端


全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但 有可能使目的基因断开，大小不可控
部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基 因完整 ②DNA片段与载体连接
2013-8-9
21

cDNA第一链的合成
2013-8-9
22
cDNA第二链的合成 ①自身引导法：获得的单链cDNA3’端会形成发夹 结构的能力，以此作为第二链合成的引物。

2013-8-9
23
cDNA第二链的合成 ②引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’ 端序列

2013-8-9
24
㈤PCR法扩增目的基因
2013-8-9
25
三、目的基因用途
①研究该基因的全貌与内涵，如详细分 析其结构、功能及调控。 ②与正常基因对比，寻找异常基因的异 常点，进而探索疾病发生的分子生物学 机理及治疗对策。 ③研究生物种系进化与相关同源性。

2013-8-9
26
④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白 质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。 ⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的 基因，以改良品种，促进经济发展。 ⑥建立基因疗法，选用某种正常基因，引入患 者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。