信阳师范学院大学生科研项目
申请书
项目类别（在相应序号上划○）
1.人文社会科学研究项目
②自然科学研究项目
所属学科：微生物学
课题名称：桑黄菌液体培养工艺的研究
申请者：郑芳
所学专业：生物科学
系（院）名称：生命科学学院
申请日期：2009.10.09
信阳师范学院制
论证报告
一、本课题研究本课题的实际意义和理论意义
1.1 本项目研究的意义：
桑黄属担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、层孔菌属,是珍贵的药用真菌, 用于治疗血崩、血淋、脱肛泻血、带下、闭经、脾虚泄泻等。

桑黄是目前国际公认的生物抗癌领域中药效非常好的药用真菌。

由于天然的桑黄菌数量非常稀少, 加上国内各产地的掠夺性开采, 已难以成为稳定的工业产品来源。

因此, 寻求人工培育的方法, 研究以大量易得的菌丝体形式代替子实体入药已成为当务之急, 这对于保护天然资源、解决资源匮乏、满足市场需要、提高经济效益, 均具有十分重要的意义。

本文探讨了桑黄菌液体发酵的最适培养基, 为进一步研究液体发酵工艺及提取桑黄有效成分做准备。

1.2同类研究工作国内外研究现状与存在的问题：
自1948年美国Humfeld H等成功地对蘑菇进行深层发酵和1958年Szuees J等以发酵罐对羊肚菌的深层培养以来，液体深层发酵技术在食药用菌制种、综合利用等方面的应用日趋广泛。

我国已进行深层发酵并工业化生产应用的食药用菌有冬虫夏草、云芝、竹荪等。

但桑黄菌液体深层培养正处于研究起步阶段，桑黄菌菌丝生长最适培养基质和培养条件尚未研究清楚，单位体积培养基质收获的菌丝量非常少。

因此，开展液体深层培养条件下对桑黄菌的营养需求特性和液体培养工艺条件进行全面深入系统的研究，以便为其发酵生产提供科学依据。

真菌多糖是非细胞毒物质，作为药物的最大优点是安全、无毒副作用，是一类理想的非特异性免疫增强剂。

其抗肿瘤作用的显著特点不是直接作用于癌细胞，而是通过参与机体免疫反应，调节机体的免疫力而使肿瘤受到抑制，起到免疫疗法的作用。

鉴于真菌多糖显著的抗癌活性及其独特的免疫增强作用，上世纪90年代在南京举行的国际食用菌研讨会上，桑黄菌已被列为当前国内外最为热门的抗癌防癌食药用菌研究之一。

但至今在国内市场上尚未见到桑黄菌多糖产品。

因此，抓住机遇，加快桑黄菌发酵多糖的开发，具有重大的社会效益和经济效益。

获取桑黄菌多糖有两条途径:一是从共生与树木根集的子囊果中提取;二是通过深层培养，从深层发酵获得的菌丝体中提取。

目前，国内正在加紧桑黄菌液体培养菌丝体技术的研究，但尚未取得技术上的突破。

概括起来，主要存在以下问题与不足:（1)缺少对液体培养桑黄菌菌丝体营养需求以及培养条件的系统的全面的研究。

对其液体培养生长特性与规律的了解不深入。

（2)液体发酵菌丝体干重低(约 lg/l0L发酵液)，工业化大规模生产尚未实现。

（3)忽略了液体培养条件下胞外多糖的研究与开发利用。

因此，开展桑黄菌液体深层培养及其活性多糖的研究，具有非常重要的现实意义和学术价值。

二、本课题的研究内容、特色和创新之处，预计突破哪些难题
2.1本项目的研究内容:
本课题拟在下列几个方面展开研究
(1)桑黄菌液体发酵最适宜营养基质的筛选研究。

(2)桑黄菌液体发酵最适宜发酵条件的研究。

(3)桑黄菌液体发酵工艺研究。

(4)桑黄菌发酵多糖的提取工艺研究。

(5)桑黄菌发酵多糖组分的分离纯化。

2.2本课题的特色
在液体培养过程中,菌丝细胞能在反应器中(锥形瓶)适温度、最适酸碱度,最适碳、氮比等条件下生长,呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放,因此新陈代谢旺盛,菌丝生长迅速,在短时间内就可以获得大量菌丝体,从菌丝体中提取生物活性强，免疫力强，对肿瘤细胞抑制力强的块菌多糖，避开了利用块菌菌株共生树木形成子囊果的漫长生长周期。

而此具有生产时间短,效率高,成本低等优点。

因此,液体发酵已作为药用真菌生产发展的一个新方向,具有很强的生命力。

2.3课题创新之处
自然界中形成的桑黄子实体非常稀少,特别是形成可用子实体需要多年,这是因为受生理生态的特殊性和复杂性及外部条件的制约,而且人工栽培难度较大.因此对桑黄菌的开发利用将转向液体发酵这一方
向。

目前日本和韩国对桑黄菌研究较多,美国和西欧对其也略有研究,国内对桑黄的相关报道较少,特别是液体培养方面。

因此采用液体培养获得菌丝体是一个较新的途径。

时至今在国内市场上尚未见到桑黄菌菌丝体多糖产品。

因此，抓住机遇，加快桑黄菌多糖的开发，具有重大的社会效益和经济效益。

2.4预计突破的难题
通过单因素实验,对桑黄菌的培养基碳源﹑氮源及培养条件进行初步探究,从而得到桑黄菌的培养基碳源﹑氮源及培养条件的最佳方案,为提高桑黄菌的培养率奠定基础,以便扩大桑黄菌的人工培养,从而实现其在生产生活中的重要应用价值。

三、本课题的研究方法、步骤、可行性论证，研究工作总体安排及进度和预期成果
3.1本课题的研究方法、步骤、可行性论证
(1)利用SAS软件优化桑黄菌发酵培养基，筛选出最适宜桑黄菌液体深层发酵所需的碳源和氮源物质。

（2）利用测量生物量的方法优化桑黄菌液体培养最适PH,最适宜的温度，和转速等条件。

（3）胞外多糖提取纯化与分析：发酵液→离心→浓缩→醇析→洗涤→得粗多糖→复溶→去除蛋白→得精制多糖→过DEAE-52层析柱和SephadexG-100层析柱→收集液浓缩→真空冷冻干燥→得多糖纯品。

（4）采用FPLC法测定块菌胞外多糖纯度和块菌多糖分子量，红外光谱分析鉴定块菌多糖。

（5）对实验结果进行总结和成果鉴定。

3.2研究工作总体安排及进度
（1）2009年10月-2010年12月, 主要完成桑黄菌液体培养基质的筛选
（2）2010年1月-2010年2月, 主要完成桑黄菌液体培养条件的研究。

（3）2010年3月-2010年6月，主要完成桑黄菌液体发酵工艺及多糖的提取工艺研究。

（4）2010年7月-2011年9月，主要完成实验结果的总结和成果鉴定。

项目结项。

3.3研究的预期目标
(1)学术期刊上发表具有较高学术价值的论文。

(2)研究开发1-2种桑黄菌菌丝体保健品。

四、研究工作的资料、设备等准备情况
实施本项目研究已具备的条件有：已收集桑黄菌菌株，并且已掌握桑黄菌液体培养的技术，收集了大量的国内外真菌多糖提取及免疫性实验的资料，这些条件为完成本课题奠定了较好的资源基础。

实验室已具有的现代化研究仪器设备有：50L全自动发酵罐、美国贝克曼公司P/ACE毛细管电泳系统、日本岛津生产的LC-10AVP高效液相色谱仪和GC-14B高效气相色谱仪等。

完成此课题所需的仪器设备齐全。

本课题组对桑黄菌已进行了许多预备实验研究。

项目指导老师张海宾毕业后一直从事微生物教学和科研工作多年，主持过河南省科技攻关项目，获得了省级奖，发表论文20多篇，掌握微生物深层发酵及培养试验技术。

其它成员通过两年专业知识的学习，掌握了实验所必须得技能，因此本课题组有足够能力实施本计划。