抗生素抗性在链霉菌菌种选育中的应用研究进展黄永春彭祎曹仁林陈志永（农业部环境保护科研监测所，天津，300191）摘要：随着链霉菌育种技术的不断发展，传统紫外、化学诱变方法已经严重滞后于当今本学科发展的需求。
采用赋予链霉菌株抗生素抗性的方法可显著提高菌株的抗生素产量，随着分子生物学技术的发展，进一步从基因角度揭示了抗性产生机理及菌株抗生素产量提高之间的关系，为该方法的发展提供了理论基础。
链霉菌的育种技术发展到今天，主要经历了自然选育、诱变育种[1]、原生质体融合[2]及生物工程[3]等技术发展阶段。
不同的育种技术在不同的时期发挥了不同作用，生物工程育种是近年来研究的热点，但当前工业化生产的农用抗生素高产菌株的选育仍以诱变育种技术为主。
其主要原因不仅仅是诱变育种技术简单易行，而且更重要的是诱变育种的处理方法越来越新颖，筛选模式越来越有效[4]且在理论指导上也由原先的随机突变原理上升到定向突变，具有了更加完备的理论指导体系。
链霉菌次级代谢产物的产生往往发生在形态分化与生理分化的转型期，例如孢子产生期，这一规律适用于绝大多数链霉菌，而且其机理目前已经了解的很清楚[7]。
研究发现，在此转型期内常常伴随着鸟苷四磷酸（ppGpp）的激增[8,9]。
Ochi等[10,11]经过详细研究后指出，ppGpp在触发链霉菌抗生素合成启动的过程中扮演重要角色。
这说明ppGpp是启动链霉菌进行次级代谢的信号分子，对链霉菌的次级代谢过程具有重要的调控作用。
鸟苷四磷酸（ppGpp）的合成受到两个基因的控制，即relA和relC。
relA基因编码鸟苷四磷酸合成酶，而relC（=rplK）基因则编码50S核糖体蛋白L11。
当relA或relC基因发生突变时，ppGpp的合成受阻[12]。
三家独立的实验室分别应用分子水平的实验方法对链霉菌模式菌株天蓝色链霉菌A3(2)进行研究发现，ppGpp的合成和抗生素的生产之间具有明确的关联[13-15]。
这就为链霉菌的定向育种提供了一条思路。
1. 链霉素抗性诱变育种当天蓝色链霉菌A3(2)的relA或relC基因发生突变，导致菌株的抗生素生产能力受损时，可通过引入链霉素抗性使其产抗生素的能力得到完全恢复[16]，这就表明在不需要ppGpp 调控的情况下链霉菌仍可以启动次级代谢过程。
据报道，获得链霉素抗性后，不仅可以影响链霉菌的产抗生素能力，而且对芽孢杆菌属和假单胞菌属的研究也表明，获得链霉素抗性的突变株其产抗生素能力较原始菌株可提高5～10倍[17]，这就证明获得链霉素抗性提高菌株产抗生素能力是一种普适方法，可适用于大多数具有产抗生素能力的细菌。
那么链霉素抗性突变菌株是如何绕过ppGpp对链霉菌的调控作用，直接启动次级代谢的合成途径，提高链霉菌抗生素产生能力的呢？为此，有学者对链霉素抗性突变株从基因角度进行了深入研究。
Hosoya,Y等[17]，以枯草芽胞杆菌（B. subtilis）高浓度链霉素（400μg/mL）抗性突变株为研究对象，对得到的11个典型突变株进行基因测序发现，在这些突变株的rpsL 基因（编码核糖体蛋白S12）内部均发生了点突变，而且检测到的氨基酸改变均发生在核糖体蛋白S12的第56位赖氨酸（Lys-56）氨基酸上。
随着第56位上的赖氨酸转换成不同种类的其它氨基酸，菌株的产素能力提高倍数也不同，例如当Lys-56转换成Arg或Thr时，产素能力提高约10倍，而当它转换成Ile时则对产素能力无影响。
然而对链霉素低抗性（5-20μg/mL）突变株的研究发现，在rpsL基因内部并未发现任何突变，且其产素能力仍可提高10～50倍。
以链霉菌模式菌株天蓝色链霉菌A3(2)(Streptomyces coelicolor A3(2))的relA突变株为研究对象，也进行了链霉素抗性的相关研究[16]。
此类菌株的ppGpp合成受阻，在获得了链霉素抗性后其产素能力提高5～10倍，但此过程并未伴随发生ppGpp的累积。
对产素能力提高菌株的rpsL基因测序表明，部分菌株核糖体蛋白S12 的88位和86位氨基酸发生改变，但仍有部分菌株中的rpsL基因未发现突变。
可见，经过链霉素筛选后，导致链霉菌突变株中编码核糖体蛋白S12的rpsL基因发生突变是使链霉菌获得链霉素抗性并提高菌株产抗生素能力的主要原因。
而且S12蛋白中发生氨基酸置换的位点以及置换氨基酸的种类都对抗生素的产量提高有明显影响。
但是显然在链霉菌中负责链霉素抗行并可有效提高抗生素产量的并不仅限于编码核糖体蛋白S12的rpsL 基因突变，因为在多篇报道中发现的链霉素低抗突变株中rpsL基因内部都未检测到点突变。
对此有报道表明编码核糖体蛋白S4的rpsD基因突变负责低浓度链霉素抗性。
链霉素对细菌核糖体的作用目前已经了解的较为清楚。
在所有的作用因素中mRNA对密码子的误读是最广为人知的，进一步研究表明链霉素可以专一性降低核糖体转录的校正能力，此外，核糖体蛋白S12的突变可影响到16S rRNA的高级结构。
因此目前对链霉素抗性提高产素能力的普遍看法是，rpsL基因突变对核糖体的转录功能造成了影响。
2. 利福平抗性诱变不仅获得链霉素抗性可恢复ppGpp合成基因缺失突变株的抗生素合成能力，有研究表明当天蓝色链霉菌A3(2)的relA和relC基因突变导致放线紫红素合成受阻时，也可通过获得利福平抗性恢复该菌株的次级代谢生产[18]。
Tamura等[19]通过赋予因卡那特链霉菌（Streptomyces incarnatus）NRRL8057利福平抗性使该菌株的抗真菌素生产能力提高了2.4倍。
这说明赋予菌株利福平抗性也是提高菌株次级代谢能力的有效方法之一。
利福平是利福霉素的半合成衍生物，在较低浓度下即可对杆菌和革兰氏阳性细菌产生较宽的抗菌谱。
Hartmann等人[20]首先证实利福平可专一性抑制RNA聚合酶。
RNA聚合酶是一个ββ’σ共5个亚基组成[21]。
早期利福平抗性机理的研究复杂的多亚基大分子，它共由α2结果都初步支持利福平的键和位点位于RNA聚合酶的β亚基：首先，RNA聚合酶的核心酶ββ’）与利福平键和紧密，而σ亚基并不直接参与和利福平的键和；其次，在大肠（α2杆菌利福平抗性菌株中发现含有变异的RNA聚合酶β亚基存在；再次，利福平敏感型和抗性菌株的亚基重组试验表明，含有源于敏感型菌株RNA聚合酶β亚基的重组菌株对利福平具有敏感性，而那些含有源于抗性菌株RNA聚合酶β亚基的重组菌株则对利福平具有抗性。
近年来，随着基因克隆技术的发展，多种研究都有力地证实，编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因突变是获得利福平抗性的主要原因[22,23]。
目前所发现的利福平抗性突变几乎都位于rpoB基因的特定保守区域内，此区域通常可划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共三个基因簇区域。
大多数的抗性突变都发生在Ⅰ、Ⅱ两个区域。
Throms等[24]以金黄色葡萄球菌为研究对象进行利福平抗性研究发现，由于rpoB基因内部发生突变导致编码氨基酸突变的种类和位置决定利福平抗性水平的高低，而且提出在体外利福平抗性存在由低至高的两步突变抗性机理，然而也同时存在单一氨基酸替换如468Gln至Lys即可引起高水平抗性的例子。
Chatterji等人的研究在一定程度上解释了利福平抗性与抗生素产量提高之间的关系[25], 他们在大肠杆菌中证实ppGpp可键合到RNA聚合酶的β亚基，而ppGpp是启动链霉菌进行次级代谢的重要信号分子。
当获得利福平抗性后，RNA聚合酶的β亚基发生突变导致ppGpp与RNA聚合酶β亚基的结合受阻，影响了次级代谢生物合成基因的正常转录。
RNA 聚合酶突变可能通过模拟ppGpp键和态发挥功能，从而绕过ppGpp的真实结合起到对次级代谢合成进行调控的作用。
3. 四环素抗性及自身抗性诱变策略获得四环素抗性也可以显著提高细菌次级代谢产物合成的能力。
Štastná等[26]通过采用紫外光等手段对榴色链霉菌（Streptomyces granaticolor）进行诱变并筛选到四环素抗性较原始菌株提高10倍的突变株，发酵液中榴菌素效价提高约2倍。
这说明使菌株获得四环素抗性也是提高菌株次级代谢生产能力的有效途径。
四环素可通过影响氨基乙酰tRNA与核糖体受体位点结合抑制人体和细菌细胞内的蛋白质合成[27]，因此在抗菌机理上与链霉素具有较大差异。
四环素必须通过一个或多个膜系统才能与他们的靶位结合，从而达到有效的杀菌作用。
因此膜系统渗透性的改变是产生四环素抗性的重要原因之一。
Štastná等通过对筛选到的四环素抗性菌株进行亚显微结构观察发现，与出发菌株相比得到的抗性菌株的细胞壁更厚、钢性更强，早期研究也表明细胞壁的组成和榴菌素的产量呈正相关性[26]。
最近对丙酸杆菌四环素抗性分离株16S rRNA的研究发现，其1058位点的鸟嘌呤被胞嘧啶取代，影响16S rRNA的第34螺旋形成，也影响肽链末端和翻译的准确性，且突变株能改变外膜孔蛋白的通透性和/或脂多糖复合物，影响细菌对四环素和其他药物的敏感性[28]。
此研究进一步从基因水平证实了膜系统通透性改变与四环素抗性之间的重要关联。
目前尚无有关四环素抗性与次级代谢生产增加之间关联的明确报道，但是菌体次级代谢生产调控系统是一个复杂的关联网络，任何形态分化上的改变都会直接或间接对此调控网络产生影响，伴随膜系统的改变、细胞壁的增厚和16S rRNA空间结构的变异，影响到次级代谢的生产应该不足为奇。
应用链霉菌自身产生的抗生素筛选自身抗性突变株也是定向筛选的重要策略。
研究表明，大多数抗生素产生菌本身没有强烈的代谢干扰作用，产生菌具有一套与临床分离得到的耐药性菌相似的自身防卫系统，此系统越完善，则对自身产物的耐药性越高，其产生高浓度抗生素的可能性越大[29]。
研究已知，链霉菌抗生素生物合成相关基因在链霉菌中有两种存在方式，一种是大多数抗生素生物合成基因存在于染色体上，另一种是某些抗生素的生物合成基因存在于游离状态的质粒上，如次甲霉素的生物合成基因存在于SCP(1)质粒上[18]。
链霉菌抗生素生物合成相关基因在染色体或质粒上往往成簇排列构成基因簇，包括抗生素的生物合成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，三者大多与抗生素生物合成基因紧密连锁并存在一种协同调节机制。
抗生素普遍存在于环境中（尤其是土壤中），对细菌的生存造成了压力，在长期的进化过程中，抗生素耐药基因在细菌中已经普遍存在，这是自然选择的结果。
在非抗生素产生菌中，抗生素耐药基因的表达主要是为了应对环境的抗生素压力。
而对某些产抗生素链霉菌而言，除了受到环境中抗生素压力外，还首当其冲的受到自身所产生的抗生素的更强压力，在长期进化中，这些链霉菌也被认为是通过自然选择积累了相应的抗生素耐药基因和调节基因，以保护自身免受这些高浓度的致命代谢物伤害。