原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。

现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。

二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。

过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。

两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。

用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。

DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。

下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。

三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。

（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。

一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。

这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。

（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。

以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。

铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。

1.2 溶液配制0.1M PB缓冲液：Na2HPO4•12H2O 5.8021g,NaH2PO4•2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中，再加入200ūl DEPC，充分摇匀后过夜，高压灭菌。

以上溶液配制两份，其中一份瓶中放入磁力搅拌子。

多聚甲醛（PFA）溶液：向配制好的有磁力搅拌子的0.1M PB缓冲液中加入8g PFA，60℃加热搅拌，并加入几粒NaOH颗粒，直至完全溶解。

20％蔗糖溶液：向另一瓶配制好的0.1M PB缓冲液中加入40g蔗糖，完全溶解。

2.取新鲜组织用事先烘烤过的剪刀和镊子（冷却至室温），选取合浦珠母贝新鲜外套膜、腮、闭壳肌等组织，迅速放入配好的4％多聚甲醛（PFA）溶液中，取组织的过程应戴口罩、一次性手套，尽量避免污染和减少RNA降解。

3.组织固定、脱水（1）将选取的组织在4％多聚甲醛（PFA）溶液中固定5～6h。

（2）用预先烘烤好的镊子将固定好的组织夹入20％的蔗糖溶液中，于4℃沉淀，直至组织块完全沉到瓶底（20h以上）。

4.冰冻切片切片在冰冻切片机上进行，生物系张秀芳老师实验室就有冰冻切片机，一般按工作时间收费，需提前预约。

切片之前将组织切成小块（按照研究要求的方向）后放在固定盘上，用专用胶将组织块完全包围，然后放入冰冻切片机里的制冷区冷凝，待组织块完全冷凝后将盘放于切片区的操纵杆上准备切片。

切片的厚度一般调至10ūm。

将切好的组织粘到盖玻片上用多聚赖氨酸处理过的一面（切忌贴到反面），同时在毛玻璃的一面用铅笔做好标记。

每张玻片上贴5～6个切片，可以是几种不同的组织。

将切完的玻片放在冰上，干燥一段时间后，放于－20℃保存。

切片的质量可以用显微镜进行检验。

（二）RNA探针标记1、将目的片段（用于标记的DNA片段，300bp以上）连接到T载体上，如PGEM-T easy 载体（转录启动子为T7和SP6），转化到大肠杆菌JM109细胞中，摇菌，提取质粒，质粒浓度尽可能大。

2、质粒线性化：将提取的质粒用载体上靠近SP6端的特异性酶（目的片段和T7端不能含有，只有SP6端有的酶切位点），如NdeI，于37摄氏度酶切10h以上。

3、琼脂糖凝胶电泳检验线性化以后的质粒，须为一条平直的条带，并利用DNA Marker确定质粒的大致浓度。

4、探针标记及纯化（1（2）37摄氏度放置2小时，然后加入2ul 3mol/L 醋酸钠和10ul 异丙醇。

（3）－20摄氏度放置2小时，然后4摄氏度12000g 离心30分钟，弃上清。

（4）50ul 70％预冷乙醇洗一次，7500g 离心5分钟，弃上清。

（5）晾干沉淀，溶于10ul无核酸酶的水中。

（6）取0.5ul作RNA凝胶电泳，其余-20摄氏度保存备用。

（三）原位杂交1、实验准备1.1器具准备镊子两把，100ml量筒一个，染色缸三个（依杂交的玻片数量来确定，每个染色缸可以同时放5张玻片），100ml试剂瓶一个，1000ml试剂瓶三个，200ml试剂瓶三个。

以上器具都在180℃以上的温度烘烤6h以上。

吸水纸，湿盒一个，杂交炉一个。

1000μl、200μl和20μl枪头各若干，121℃高压灭菌25min以上。

1.2溶液配制DEPC水：1000mldd H2O中加入1ml DEPC，充分摇匀，于室温过夜，高压灭菌。

考虑到DEPC水用量较大，一般同时准备两瓶DEPC水。

3％柠檬酸：100mlDEPC水中加入柠檬酸3g，PH2.0左右。

2×SSC：1000ml DEPC水中加入NaCL17.6g，柠檬酸三钠8.8g。

0.5×SSC：150ml DEPC水中加50ml 2×SSC即可。

0.2×SSC：80 ml DEPC水中加120ml 0.5×SSC即可。

0.5M TBS：1000ml DEPC水中加NaCL30g，Tris 1.2g，纯乙酸0.4－0.5ml，PH7.2-7.6。

0.01M TBS（PH9.0-9.5）：1000mlDEPC水中加入NaCL9g，Tris 1.2g。

2、杂交步骤（1）灭活内源性碱性磷酸酶（AP）：将切片用20％的乙酸处理10min，以灭活内源性的碱性磷酸酶。

（2）暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化90－120秒。

0.5M TBS洗3次×5分钟，DEPC水洗5分钟。

（3）预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部垫上吸水纸，用蒸馏水充分润湿。

按照每张切片20μl加预杂交液。

40℃恒温3小时，吸取多余液体，不洗。

（4）稀释探针：将用地高辛标记好的RNA探针于65℃加热变性8min，用杂交液稀释为2μg/ml。

（5）杂交：每张切片加20μl稀释好的探针，将原位杂交专用盖玻片盖在切片上，50℃杂交过夜。

（6）杂交后洗涤：揭掉盖玻片，2×SSC洗5min×3次。

（7）消化残余的RNA：用2×SSC稀释RNase A 到20μg/ml，处理30min。

（8）洗涤：2×SSC于37℃洗涤10min×3次；0.5×SSC室温洗涤5min×3次；0.2×SSC室温洗涤5min×3次。

（9）滴加封闭液：37℃处理30min，吸去多余液体，不洗。

（10）滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃处理1h，0.5M TBS洗涤5min×4次。

注意：勿用其它缓冲液或水洗。

（11）滴加SABC-AP：37℃处理30min，0.5M TBS洗涤5min×4次。

注意：勿用其它缓冲液或水洗。

（12）BCIP/NBT显色：用0.01M TBS将BCIP/NBT稀释50倍，混匀。

显色液加至标本上，一般37℃下避光显色20min。

若无背景出现可继续显色。

用DEPC水充分洗涤。

（13）水溶性封片剂封片。

附I DNA探针处理方法用DNA做杂交探针的话，处理方法如下：1.将目的片段（用于标记的DNA片段，300bp以上）用无菌双蒸水稀释至16μl。

2.将稀释好的DNA用沸水浴（100℃）10min，冰上3min以上变性。

3.加4μl事先摇匀的DIG-High Prime，混匀，2000rpm离心5min。

4.37℃反应2h以上，通常过夜至20h。

5.加2μl0.2M EDTA(PH8.0)中止反应或65℃加热10min中止反应。

6.－20℃保存（一般可以保存一年）。

附II 过氧化物酶（POD）检测（MK1030型）试剂盒原位杂交操作步骤一、溶液配制1、DEPC水：1000mldd H2O中加入1ml DEPC，充分摇匀，于室温过夜，高压灭菌。

考虑到DEPC水用量较大，一般同时准备两瓶DEPC水。

2、3％柠檬酸：100mlDEPC水中加入柠檬酸3g，PH2.0左右。

3、2×SSC：1000ml DEPC水中加入NaCL17.6g，柠檬酸三钠8.8g。

4、0.5×SSC：150ml DEPC水中加50ml 2×SSC即可。

5、0.2×SSC：80 ml DEPC水中加120ml 0.5×SSC即可。

6、0.5M PBS：1000ml蒸馏水加NaCL30g，Na2HPO4•12H2O 6g，NaH2PO4•2 H2O 0.4g，PH7.2-7.6。

二、原位杂交操作(1)灭活内源性过氧化物酶（POD）：将切片用0.5％H2O2/甲醇室温处理30分钟以灭活内源性的过氧化物酶，后用DEPC水洗3次。

(2)暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化90－120秒。

0.5M TBS洗3次×5分钟，DEPC水洗5分钟。

(3)预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部垫上吸水纸，用蒸馏水充分润湿。

按照每张切片20μl加预杂交液。

40℃恒温3小时，吸取多余液体，不洗。

(4)杂交：每张切片加20μl稀释好的探针，将原位杂交专用盖玻片盖在切片上，42℃杂交过夜。

(6)杂交后洗涤：揭掉盖玻片，2×SSC于37℃洗涤10min×3次；0.5×SSC室温洗涤5min×3次；0.2×SSC室温洗涤5min×3次。

(7)滴加封闭液：37℃处理30min，吸去多余液体，不洗。

(8)滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃处理1h，0.5M PBS洗涤5min×4次。

注意：勿用其它缓冲液或水洗。

(9)滴加SABC：37℃处理20min，0.5M PBS洗涤5min×4次。