原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4） PBS清洗3分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗10分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；8） PBS清洗2次，每次3分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；19）PBS清洗5分钟；20）室温，2×SSC清洗10分钟；21）37℃，1×SSC清洗10分钟；22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；23）缓冲液A孵育10分钟；24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。

2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4） PBS清洗5分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗5分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；8） PBS清洗2次，每次5分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2×SSC清洗10分钟；18）37℃，1×SSC清洗10分钟；19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。

FISH步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。

将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。

37℃孵育20min。

3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。

3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。

4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

检测：9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。

把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。

1×PBS室温下洗3次，每次2min。

扩增：12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。

1×PBS室温下洗3次，每次2min；15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。

5、细胞核染色：1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。

切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

地高辛标记寡核苷酸探针1．组织处理（1）冷冻切片：厚10～20μm，贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。

切片保存于-80℃，在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。

PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。

（2）石蜡包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蜡，以100%乙醇10min ×2，空气干燥10min，从高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每个浓度。

PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。

（3）离心细胞涂片：将细胞先以4%多聚甲醛固定，应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上，应用PBS（含5mmol/l MgCl2）5min×3漂洗。

在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。

在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。

孵育在2×SSc 10min。

2．探针准备35pmol的寡核苷酸（oligo -）探针，3’ 终末标记以地高辛-11–dUTP。

3．预杂交和杂交加约300μl预杂交液（配制法见附录）在每张载片上，室温孵育1h。

如为鲱鱼精子DNA，在应用前须在沸水浴中加热10min，而对酵母tRNA可不用加热变性。

（1）应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针，探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。

如对于检测大鼠垂体的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo –探针，其理想工作浓度为342ng/ml(0.342ng/μl)。

（2）预杂交后以2×SSC漂洗，以吸水纸拭干切片周围水份，加30μl杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在37℃过夜。

如探针大于36碱基则杂交温度为42℃。

次日室温2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室温），0.5×SSc 37℃洗半小时，0.5×SSC室温漂洗半小时。

4．地高辛显示。

地高辛标记cRNA探针1．组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚10～30μm）最佳。

切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37℃预干燥4h，然后置于37℃烤箱中过夜。

经过上述处理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。

但仍以新鲜制片为好。

如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。

一般不提倡浸入二甲苯溶液。

但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。

经水洗后入37℃烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。

在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸（foilpaper）包被，内加少许干燥剂（变色硅胶）。

下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。

（1）PBS洗2×3min。

（2）选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。

其它切片暂放于PBs 内。

RNA酶对照片处理方法：加RNA酶（100μg/ml）在预热37℃的溶液内。

放在潮湿的盛有少许2×SSC 塑料盒或蒸发皿内。

在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗，2×3min，然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。

（3）蛋白酶K消化：将组织切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，内含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。

消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。

时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。

（4）0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。

0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。

（5）在4%多聚甲醛/PBS3min。

（6）以PBs 漂洗2×3min。

（7）浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min，以封闭非特异性结合部位。

（8）2×SSC漂洗15min。

2．杂交以含cRNA探针（0.5ng/ml）的杂交液，按每张切片10～2μl的量覆盖切片。

地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。

覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2×SSC 温盒内在42℃，16～18h或过夜。

3．显示（1）用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。

（2）在缓冲液1中10min，室温以封闭非特异性结合部位。

（3）拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。

加数滴抗地高辛抗血清（工作浓度1：500，以缓冲液1稀释），孵育2h，室温。

（4）缓冲液1漂洗3×3min。

（5）浸入缓冲液210min室温。

（6）浸入底物中孵育10～30min（或更长时间，视需要而定），底物内含显色BCIP/NBT，室温。

最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。