微生物菌种分离和鉴定技术微生物纯培养分离技术获得纯培养物对微生物学研究至关重要。
纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。
液体培养基菌悬液连续稀释培养容器中仅含1个菌体单个菌体纯培养物固体培养基无菌土豆片1881年很多细菌不能在土豆上生长肉膏蛋白胨培养基明胶固化明胶高温易溶化不能37?C培养琼脂固体培养基1882年一直沿用至今方法冗长结果不稳定易污染微生物纯培养分离技术纯培养物分离方法固体培养基分离涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法液体培养基分离单细胞孢子分离选择培养分离涂布平板法1、少量样品加到平板中央1mL2、玻璃三角涂棒浸入酒精3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面适当条件下培养平板划线法斜线法曲线法方格法放射法四格法平板划线法斜线法用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条再转动培养皿70?角并将接种环上剩余物烧掉待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。
曲线法将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。
平板倾注法对起始样品进行连续10倍稀释将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀培养后获得单菌落。
培养基表面菌落为圆形而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。
稀释摇管法适合厌氧菌的纯培养物分离无菌琼脂培养基试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50?左右待分离的菌种用这些试管进行梯度稀释摇匀、冷凝在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物培养后菌落形成在琼脂柱的中间液体培养基分离不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。
稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。
在同一个稀释度的许多平行试管中大多数一般应超过95表现为不生长。
单细胞孢子分离单细胞或单孢子分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。
较大的微生物可采用毛细管提取单个个体。
个体相对较小的微生物需采用显微操作仪在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。
单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。
单细胞孢子分离选择培养基分离传统选择性培养基血平板适于各类细菌的生长一般细菌检验标本的分离都应接种此平板。
巧克力血平板其中含有V和X因子适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。
中国蓝平板或伊红美蓝平板可抑制革兰阳性细菌有选择地促进G-菌生长是较好的弱选择性培养基。
麦康凯平板具中等强度选择性抑菌力略强有较少革兰阴性菌不生长。
SS琼脂有较强的抑菌力用于志贺菌和沙门菌的分离。
碱性琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。
血液增菌培养基用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。
营养肉汤用于标本及各类细菌的增菌新型显色培养基利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的培养基。
微生物快速分离、计数方法Petrifilm Plate 3M微生物快速分离、计数方法3M Petrifilm PlateAerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count PlateE. coli/Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count PlateStaph. aureusExpress Count Plate Environmental ListeriaPlate 微生物快速分离、计数方法Compact Dry NISSUI微生物快速分离、计数方法Compact Dry NISSUI微生物菌种鉴定技术分类等级界Domain门Phylum纲Class科Family 属Genus种Species三界系统发育树细菌真核生物古菌“种”微生物基本分类类群微生物菌种鉴定技术“种”的定义一个种基因型种是有相似GC组成并通过DNA杂交试验判断有70或更大相似性的菌株的集合。
表征分类Phenotic system 数值分类Numerical Taxonomy系统发育分类Phylogenetic多相分类Polyphasic taxonomy鉴定Identificaiton根据相似性或亲缘关系确定分类类群分类单元确定新的分离物属于已知分类单元的过程。
微生物菌种鉴定技术微生物菌种检验微生物菌种鉴定目标菌检验它是不是某一种菌未知菌种鉴定:它是什么菌控制菌大肠埃希菌Escherichia coli大肠菌群Coliform 沙门菌Salmonella铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus梭菌Clostridium白假丝酵母Candida albicans致病菌大肠埃希菌Escherichia coli大肠菌群Coliform沙门菌Salmonella金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes阪岐肠杆菌Enterobacter sakazaki致贺氏菌Shigella副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus空肠弯曲菌Campylobacter jejuni产气荚膜梭菌Clostridium perfringens蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus规范的检测鉴定方法GB/T 4789.3-4.5.6.7.9.10.13.14.30.40常规鉴定常规鉴定首先掌握菌株的基本特征如细胞的形状、革兰氏染色及其他形态学特征营养类型、需氧性等生理生化特征。
在此基础上查阅分类鉴定手册确定菌株属于哪一大类群、组进行特征测定。
根据测定结果逐步缩小菌株的归属范围初步确定科、属。
如菌株需鉴定至种则进一步测定种的鉴别特征。
如鉴定结果涉及新的分类单元则进行包括基因型在内的全面鉴定。
用于鉴定的形态学特征特征微生物类群细胞形状所有主要类群细胞大小所有主要类群菌落形态所有主要类群超微结构特征所有主要类群染色行为细菌、一些真菌纤毛和鞭毛所有主要类群运动机制滑行细菌螺旋体内生孢子形状和位置形成内生孢子细菌孢子形态和位置细菌、藻类、真菌细胞内含物所有主要类群颜色所有主要类群用于鉴定的生理生化特征碳源和氮源运动性细胞壁组成渗透耐性能源氧关系发酵产物最适pH和生长范围一般营养类型光合作用色素最适生长温度和范围盐需求及耐性发光次级代谢产物形成能量转换机制对代谢抑制剂和抗生素的敏感性贮藏内含物微生物菌种鉴定的问题随着分类学的发展微生物分类越来越多的以核酸序列系统发育分析来建立新的分类单元和对原有分类单元进行调整。
产生新的问题将有越来越多的分类单元不能只以表型特征进行鉴别必须结合基因型测定才能鉴定。
微生物菌种鉴定技术表征表型特征形态特征生理和代谢特征生态特征遗传基因型特征蛋白质比较核酸碱基组成核酸序列多相鉴定技术Polyphasic Identification TechnologyErko StackebrandtDSMZ Braunschweig Germany分子标尺微生物菌种鉴定技术伯杰氏鉴定细菌学手册Bergeys Manual of Determinative Bacteriology伯杰氏系统细菌学手册Bergeys Manual of Systematic Bacteriology19231、19252、19303、19344、19395、19486、19577、19748、199491984-19891、2001-20102微生物菌种多相鉴定技术基因型鉴定技术Genotype IdntificationGCmol RAPD SSCP DGGE LAMP RFLP DNA-DNAhybridization repPCR 16S rDNA 26S rDNA D1/D2 5.8S rDNA ITS region β-tubulin gene calmodulin gene gyrA gene pheS gene etc.DNA Barcoding gene sequence analysis Multi-LocusSequence Analysis MLSA 基因型鉴定技术水平不同指纹图谱和DNA分析技术的鉴定水平2007年Aspergillus brasiliensissp.nov.新种发表ATCC16404黑曲霉Aspergillus niger2008年ATCC 16404 鉴定为Aspergillusbrasiliensissp.nov.2010年USP将ATCC 16404 更名2010年WDCM 将ATCC 16404 更名图ATCC 16888和ATCC 16404的培养特征和显微形态a??nos Varga Sa??ndor Kocsube?? Bea??ta To??th et al. Aspergillusbrasiliensissp. nov. a biseriate black Aspergillusspecies withworld-wide distribution.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2007 57: 1925–1932图:Rep-PCR条码系统发育树DiversiLab平台Figure 2: Dendrogram of Rep-PCR Barcoding DiversiLab Platform .注图片来源于Reclassification of ATCC?? 16404TM and ATCC?? 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology ForumNewsletter 2008 Vol. 14 10: 2-14表ITS序列特殊位点碱基差异Table Difference of base position in ITS sequence2007年Aspergillus brasiliensissp.nov.新种发表ATCC16404黑曲霉Aspergillus niger2008年ATCC 16404 鉴定为Aspergillus brasiliensissp.nov.2010年USP将ATCC 16404 更名2010年WDCM 将ATCC 16404 更名图: 基于曲霉黑色组β-微管蛋白基因序列的N-J树Figure : Neighbour –joining tree based on β-tubulinsequence data of Aspergillus section Nigri..注图片来源于Aspergillus brasiliensis sp. nov. a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution International. Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology 2007 57: 1925–1932图1: 基于ITS DNA序列的黑色曲霉N-J树Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based onTheir ITS DNA Sequences.注图片来源于Reclassification of ATCC??16404TM and ATCC?? 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology ForumNewsletter 2008 Vol. 14 10: 2-14各种标准中仍将继续采用ATCC 16404作为质控菌株。