双歧杆菌的分离、培养及鉴定一实验目的1 掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。

2 观察双歧杆菌的形态特征并了解双歧杆菌的生长特性。

3了解双歧杆菌鉴定的一般方法。

二基本原理厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。

双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。

初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长。

其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。

单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。

革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。

双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。

双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。

该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。

该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。

双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。

这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。

本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。

以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。

该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。

目前，双歧杆菌鉴定的方法有很多种。

近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建，分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性；RAPD技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型。

一般来讲，我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法，主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等。

三实验用具高纯氮气厌氧管注射器培养箱冰块水浴锅镊子记号笔 MRS培养基细菌生化微量鉴定管酒精棉球瓷盘振荡器铜柱除氧系统定量加样器恒温水浴载玻片显微镜恒温培养箱超声波破碎仪滤纸层析缸酒精灯封口膜厌氧罐等。

四、实验方法与步骤1 铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。

此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。

铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。

由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。

当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。

此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。

当然H2源也可以由氢气发生器产生。

2 预还原培养基及稀释液的制备制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。

此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。

3 分离（1）编号取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。

（2）稀释在无菌条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。

用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。

依此进行10倍系列稀释，至10-7，制成不同样品稀释液。

通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管计数。

（3）滚管分离1）滚管将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。

2）分离生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。

如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。

待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。

然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。

同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。

将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。

37℃培养。

培养24h或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。

4 计数并镜检（1）计数液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。

然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有的双歧杆菌数量。

公式如下：双歧杆菌数量cfu/g（mL）样品=0.1mL滚管计数的实际平均值×10×稀释倍数（2）镜检挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。

5 菌种鉴定⑴双歧杆菌特定酶的检测利用果糖-6-磷酸盐对分离得到的菌种进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）的测定，初步确定菌种是否为双歧杆菌属。

F6PPK测定的操作如下：①将从样品中分离出的双歧杆菌培养于厌氧液体改良MRS培养基中37℃生长24 h。

②将菌液4400 rpm离心10 min,收集菌体，缓冲液ⅰ洗涤2次，最后溶于约4 mL缓冲液ⅰ中，制成细菌悬液。

缓冲液ⅰ：现用现配。

取0.05 M Na2HPO4 31.5 mL和0.05 M NaH2PO4 68.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-盐酸盐。

③用超声波粉碎仪，400 W条件下；每处理5 s、间隔5 s,超声粉碎8 min，至菌体溶液呈半透明。

④破碎后，取0.5 mL 于离心管中，加试剂ⅱ和ⅲ各125 µL,37℃保温30 min。

ⅱ 6 mg/mL氟化钠加10 mg/mL 碘乙酸钠。

ⅲ果糖-6-磷酸盐80 mg/mL水溶液。

⑤加试剂ⅳ 0.750mL, 室温10 min。

ⅳ现用现配。

盐酸羟胺139 mg/mL。

酸性极强，用氢氧化钠中和至pH6.5。

⑥加试剂ⅴ和ⅵ各500 µL, 室温5 min。

ⅴ三氯乙酸（TCA）水溶液15 g/100 mL。

ⅵ 4 M HCl。

⑦加试剂ⅶ 500 µL, 显色。

红褐色或红紫色为阳性，黄色为阴性。

ⅶ 0.5 g/100 mL FeCl3·6H2O溶于0.1 M HCl。

⑵乙酸、乳酸等有机酸的测定——纸层析法①层析滤纸的制备——将层析滤纸剪成1.5cm*11cm的长条状，在距层析纸一端约4cm 处用铅笔划线确定点阳线，使用前充分干燥。

②配制展开剂——正丁醇:甲酸:水=80:15:5③配制标准液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液④制备待测样品——将菌种37℃培养24h后离心，收集上清液⑤点样——用毛细管分别吸取发酵液，多次点样于滤纸条上，样点直径不宜超过2mm，平衡2h⑥层析——将点好样的层析纸放入，使点有样品的一端浸在展开剂中，但不可浸及样点。

观察展开情况，待展开剂前沿到达离层析纸另一端约1.5cm处，取出层析纸。

⑦显色——以3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸喷洒并计算Rf值。

注释：物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用R f值(比移值R f value 又称R f值) 来表示：R f = 原点到层析中心的距离/ 原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的R f值是常数。

R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关，是一个定性分析的重要参数。

⑶糖发酵试验糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。

绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。

例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

酸的产生可以利用指示剂来断定。

在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。

气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

本实采用现成的细菌生化微量鉴定管，鉴定管的种类如下：乳糖麦芽糖甘露糖甘露醇蔗糖阿拉伯糖 D-核糖木糖（木胶糖）半乳糖松三糖山梨糖淀粉水杨素葡萄糖酸盐草糖（海藻糖）血清菊糖棉子糖果糖蜜二糖纤维二糖具体实验步骤：①将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

②将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

③ 24h后观察各管中液体变颜色情况，若变色则为阳性，反之阴性，对照凌代文编著的《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》“鉴别双歧杆菌属内种的特征”表即可初步确定其种别。

五注意事项1 注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。

2 注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。

每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。

3 用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。

六实验结果表一双歧杆菌培养过程中菌落计数表二双歧杆菌菌株属的鉴定指标与鉴定结果鉴定项目试验结果鉴定项目试验结果革兰氏染色乙酸含量细胞形态乳酸含量F6PPK 乙酸:乳酸3：2表三双歧杆菌菌株糖醇发酵试验结果试验项目结果试验项目结果D-核糖甘露糖L-阿拉伯糖果糖乳糖半乳糖纤维二糖蔗糖松三糖缺麦芽糖棉子糖海藻糖山梨醇蜜二糖淀粉甘露醇葡萄糖酸钠菊糖木糖水杨苷注：表中+表示待测菌株阳性，-表示待测菌株阴性七思考题1 比较平板计数和滚管活菌计数的异同？2 要使滚管计数准确要掌握那几个关键步骤？3 双歧杆菌的特征性形态是什么？与常规杆菌相比，有何具体特征？4 鉴定双歧杆菌的方法及指标除了本实验内容外还有哪些？5 纸层析中若乳酸、乙酸条带没有全部显现，请问是何原因？6 F6PPK试验中若结果为阴性，可能会有哪些原因？7 糖醇发酵试验中是否会出现假阳性？分析其可能的原因。