第42卷第5期2008年9月生 物 质 化 学 工 程B iomass Che m ical Eng i n eeringV o.l 42N o .5Sep .2008黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的研究收稿日期:2008-02-20基金项目:国家自然科学基金(30471361),江苏省高校自然科学重大基础研究项目(06KJ A22015) 作者简介:刘敏(1981-),女,江苏徐州人,硕士生,主要从事生物质资源生物降解与转化的研究*通讯作者:勇强,教授,博士生导师,主要从事生物质资源生物降解与转化和制浆造纸生物技术研究。
刘敏,欧阳嘉,勇强*,余世袁(南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037)摘 要:研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。
麸皮是黑曲霉B -葡萄糖苷酶的较适诱导物。
黑曲霉NL02以40g /L 麸皮为碳源,在250mL 三角瓶中装液40mL,接种量8%,初始p H 值5.5,30e 、170r /m in 下培养10d ,B -葡萄糖苷酶活力为19.12I U /mL 。
B -葡萄糖苷酶最适温度为65e ,40e 时稳定性较好;最适p H 值为4.8,在p H 值3.0~5.0之间稳定性较好。
关键词:黑曲霉;B -葡萄糖苷酶;麸皮中图分类号:TQ91;Q 55 文献标识码:A 文章编号:1673-5854(2008)05-0005-04Preparati on of B -G l ucosi dase by A s p er gillus ni ger i n Sub merged Fer m entati onL IU M i n ,OUYANG-Jia ,YONG Q iang ,YU Sh-i yuan(Co ll ege of Chem ical Eng i neeri ng ,N anji ng F orestry U niversity ,N anji ng 210037,Ch i na)Abstrac t :The effects o f culture cond iti on on B -g lucosidase prepara ti on by A sp ergillus ni ger i n sub m erged fer m en tati on and the apparen t enzym ati c properties of B -g l ucosi dase we re i nvestigated .W heat bran w as the opti m a l i nducer o f B -g l ucosi dase a m ong tested carbon sources .T he opti m al culture cond iti on o f B -g l ucosi dase preparati on by A.n i ger i n subme rged fer m entati on w as 40mL m edi u m i n 250mL shake fl ask ,the i nocu lati on w as 8%,the i nitial p H value w as 5.5,t he culture te m perature and rota -ti on speed of Incuba t o r Shaker w ere 30eand 170r /m in ,respecti ve l y ,and the h i ghest B -g lucosidase acti v ity of 19.12I U /mLw as ob tained for 10days culti v ati on .The opti m a l te m perature and p H va l ue o f B -g l uco si dase reac ti on w as 65e and 4.8,respec -ti ve l y .The B -g l ucos i dase was stab l e unde r 40eand i n t he env iron m ent p H value o f 3.0-5.0.K ey word s :A spergilli us ni ger ;B -g lucosidase ;wheat branB -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是纤维素酶系的主要组分,其在纤维素水解过程中的作用是将纤维素经内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)作用产生的纤维低聚糖和纤维二糖水解成葡萄糖[1]。
除了纤维素糖化外,B -葡萄糖苷酶还广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织、造纸和农业等领域[2]。
虽然自然界中大多数能够分泌纤维素酶的微生物也能合成B -葡萄糖苷酶,但不同的微生物合成B -葡萄糖苷酶的能力有差异。
黑曲霉(A s pergillus niger )是较好的B -葡萄糖苷酶生产菌株,本文作者研究了培养条件对黑曲霉NL02液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。
1 实验1.1 菌种黑曲霉(A s p ergillus ni g er )NL02,由南京林业大学生物化工研究所保藏。
1.2 材料麸皮,收集于江苏省徐州市,粉碎至0.20~0.28mm;玉米芯、玉米秸秆,收集于江苏省盐城市,粉碎至0.20~0.28mm;硫酸盐纸浆,南京林业大学制浆造纸工程研究所提供;羧甲基纤维素,由上海国药集团提供。
1.3 培养基斜面培养基:PDA 培养基。
种子培养基:6生物质化学工程第42卷M andels培养基[3]。
发酵培养基:麸皮40g/L, (NH4)2SO44g/L,KH2PO43g/L,M gSO4#7H2O0.4g/L,C a C l20.5g/L。
1.4种子制备一定量的种子培养基置于250m L带棉塞的三角瓶中,于121e、30m in灭菌冷却后接入黑曲霉孢子,于170r/m i n、30e下培养48h后获得菌丝体种子液。
1.5B-葡萄糖苷酶的制备一定体积的产酶培养基置于250mL带棉塞的三角瓶中,接种量分别为6%、8%、10%、15%、20%、25%和30%(体积分数),于170r/m in、30e的恒温摇床上培养10d,培养液于3000r/m in下离心10m in得到粗酶液。
1.6最适pH值及酸碱稳定性的测定分别用不同pH值缓冲液配制的对硝基苯基-B-D-葡萄糖苷(pNPG)溶液为底物,按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以最高酶活力的相对百分数表示。
取适量的B-葡萄糖苷酶液,与一定体积的p H值为3.0~8.0的缓冲溶液混合后于50e下处理2h,按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以原酶活力的相对百分数表示。
1.7最适温度及热稳定性的测定在55~75e范围内,按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以最高酶活力的相对百分数表示。
取适量的B-葡萄糖苷酶液在pH值4.8,温度分别为40、50、60e下保温3h,每隔30m i n 取样按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以原酶活力的相对百分数表示。
1.8分析方法还原物的测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[4],B-葡萄糖苷酶活力、滤纸酶活力按国际标准方法测定[4-5]。
2结果与讨论2.1碳源对B-葡萄糖苷酶的诱导作用B-葡萄糖苷酶属于诱导酶类,其生物合成受到诱导调节控制,碳源通常是酶合成的诱导物质。
不同碳源对黑曲霉NL02合成B-葡萄糖苷酶的诱导作用如图1。
图1不同碳源对B-葡萄糖苷酶合成的影响F i g.1Th e effec t of carbon sources on the prep ara-tion of B-g l ucosidase由图1可知,不同碳源诱导黑曲霉合成B-葡萄糖苷酶的能力不同,麸皮对B-葡萄糖苷酶的诱导作用最强。
黑曲霉NL02以40g/L的麸皮为碳源时,B-葡萄糖苷酶活力达到6.00I U/mL,而以相同浓度的玉米芯为碳源,B-葡萄糖苷酶活力仅为2.61I U/mL。
从图1还可看出,随着原料中纤维素聚合度的增加,碳源对B-葡萄糖苷酶的诱导作用逐步降低,说明低聚合度的纤维素对B-葡萄糖苷酶的诱导作用较强。
当碳源为聚合度较高的硫酸盐纸浆和羧甲基纤维素时,B-葡萄糖苷酶活力仅为0.26和0.22I U/mL。
2.2培养条件对B-葡萄糖苷酶合成的影响2.2.1初始p H值的影响黑曲霉NL02以40g/L的麸皮为碳源,培养基初始pH值对B-葡萄糖苷酶合成的影响如图2。
由图2可知,培养基初始p H值为5.5时B-葡萄糖苷酶活力最高,达6.18I U/mL,高于或低于最适pH值,酶活力都呈下降趋势。
图2初始pH值对B-葡萄糖苷酶合成的影响F i g.2Th e effect of i n iti al p H val ue on th e prep ara-tion of B-g l ucosi dase第5期刘敏,等:黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的研究72.2.2 接种量的影响 接种量对B -葡萄糖苷酶合成的影响如图3。
由图3可知,在较低接种量时,酶活力随着接种量的增加而增加,当接种量为8%时酶活力达到最高值5.73I U /mL ,之后随着接种量的增加,酶活力呈下降趋势,当接种量为30%时,B -葡萄糖苷酶活力仅为1.91I U /m L 。
图3 接种量对B -葡萄糖苷酶合成的影响Fig .3 The effect of i nocu lation a m ount on thepreparation of B -glucosidase2.2.3 装液量的影响 黑曲霉NL02在250mL 三角瓶中分别装液30、40、50、60和70m L ,初始p H 值为5.5的培养基,接种量为10%,于30e 、170r /m in 下培养,装液量对B -葡萄糖苷酶合成的影响如图4。
装液量在一定程度上反映氧的供应,在相同摇瓶体积下,装液量越小,氧的供应则越大。
由图4可知,在250mL 的三角瓶中装液量为40mL 时,B -葡萄糖苷酶活力最高,达到11.29I U /mL 。
当装液量超过40mL 时,溶氧状况变差,酶活力迅速下降,当装液量提高到70mL 时,B -葡萄糖苷酶活力仅为3.46I U /m L。
图4 装液量对B -葡萄糖苷酶合成的影响Fig .4 The effect of m ed i um ch arge on th epreparation of B -glucosidase2.3 黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶历程在250mL 三角瓶中,黑曲霉以40g /L 麸皮为碳源,在装液量40mL 、初始pH 值5.5、接种量8%、30e 、170r/m i n 下培养,培养过程中B -葡萄糖苷酶活力、滤纸酶活力随时间的变化如图5。