Excitation
SG
5’ 3’
SG SG SG
3’ 5’
SG
实时检测: 双标记探针
5’
5’
3’
激发 激发
RR
3’
R
3’
3’
5’
Q
Q
5’
引物和探针的设计
免费的基于网络的设计软件
Primer3（/） • 引物和双标记水解探针的设计 • Tm的计算
MFold（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html） • 引物和扩怎产物二级结构的预测 • 二级结构的稳定性(delta G) 和融解温度 (Tm)
标准曲线可通过已知浓度的cDNA/RNA来构建
注意事项: - DNA/RNA纯度 - 精确移液 - 标准品的稳定性 - 避免DNA作为RNA的标准品
Two Standard Curves
Concentration normalisation (ratio) = mean G.O.I / mean Ref. Relative value = Ratio Sample / Ratio Calibrator
引物的设计
扩增产物 • 产物越短，反应效率越高 • 理想状态为75–150 bp • 避免形成稳定的颈环二级结构 • 避开回文序列 • 避开G/C含量较高的序列
引物 • 避免二级结构 (发卡) • 避免出现4个连续相同的碱基 (尤其是G) • 尽量避免二聚体 • 长度18–25 nt • Tm值: 60oC • GC含量: 45–55 % • 保证引物特异性 • 引物不含有内含子序列
逆转录酶 • 较高的逆转温度可以减少cDNA二级结构的形成 (Freeman et al. 1996).
逆转录效率 • 理论上RNA/mRNA逆转录成cDNA的效率是100% (< 70%) • 单链结合染料Oligreen® 可以用于测定cDNA的浓度
实时扩增
荧光物质的选择
插入式染料 • 成本低 • 适用于所有的双链 • 研究基因较多时适用 • 特异性低
BLAST • 结构特异性
探针设计原则
• 引物与探针的距离<10碱基 • 避免二级结构 • GC含量: 45 – 55 % • 探针Tm高于引物10 oC 左右 (70 oC) • 5’端保证不是G • 探针少于30个碱基 • 3’端最后5个碱基不要超过 2C或2G • 3’端添加磷酸基团 • BLAST 保证探针特异性
基因型分析
绝对定量
综述: Absolute Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assays. SA Bustin J. Mol. Endo 2000 25,169-193
MgCl2浓度 • Mg2+ • 最优的MgCl2浓度: 1.5–3.5 mM
反应优化(双标记水解探针)
引物和探针浓度
• 引物浓度25–900 nM • 探针浓度10–250 nM • 引物:探针= 3:1 • 最优的引物浓度: Ct值较小、信噪比较高 • 电泳分析确定扩增产物的长度
水 229.5 µl
反应优化 (掺入式染料)
SYBR® Green I 浓度 • 不同稀释倍数进行实验 • 较高浓度抑制PCR反应 • 较低浓度导致信号较低
引物浓度 • 上下游引物浓度: 300 nM • 固定DNA模板浓度进行优化 • 阳性对照和阴性对照 • 最优的引物浓度: Ct值较小、信噪比较高 • 融解曲线分析扩增产物特异性 • 电泳分析确定扩增产物的长度
10 x 缓冲液 85 µl
MgCl2 51 µl
dNTP 68 µl
Taq 8.5 µl
DNA 34 µl
10 µl 6.25 µM
probe
下
4.5µM
游
引
物
1.5µM
+ 5µl
0.25µM
取140 µl 预混液加入下列反应管中
10 µl 3.75 µM
probe 取15 µl 加入下列PCR反应管中
实时荧光定量PCR 实验的设计及结果的分析
基因有限公司 王争强
术语
对照组：用作对照的样本，与实验组进行比较 实验组：未知样本，用于研究 目的基因(GOI)：用于研究的基因 内参基因(看家基因)：基因表达量比较恒定的基因，用于校正起始上样量的区别 参比样本(Calibrator): 用于比较的样本，如未处理样本、正常组织、0时相样本等 标准品(Standards)：梯度稀释的已知浓度的样品，测定未知样品的浓度和反应效率 Ct值： 样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数 反应效率(E)：PCR扩增的速率
Software steps
∆∆CT或 比较 CT 分析
• 无需标准曲线 • 测定相对表达量 • GOI和REF反应效率相同或者相似（需验证） • 假定反应效率100%.
Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^[ -delta delta C(T) ] Method. Livak KJ & Schmittgen TD. Methods 2001 Dec;25(4): 402-408
总结
•减少样品与反应间的差异 •选择合适的方法并优化 •分析数据
RT-qPCR流程示意图源自 RNA 提取样本的准备 • 速度 (RNA 降解) • RNA酶抑制剂 • 保存条件
分离试剂的选择 • 液态或组织 • 植物、动物或者微生物
RNA 质控 • RNA的完整性 • RNA的纯度 • RNA的浓度 • 抑制因子的影响
逆转录
逆转录引物 • 随机六核苷酸引物 (总RNA) 或者 OligodT 引物 (mRNA) • 扩增产物在5’端时，尽量避免用OligodT做引物
add 10 µl 1.25 µM probe
4.5µM 1.5µM 0.25µM
4.5µM 1.5µM 0.25µM
+ 5µl 上游引物
4.5µM 1.5µM 0.25µM
定量分析
定量方法的选择
绝对定量 相对定量
- 双标曲线
- ∆∆CT - Assumption Free Analysis (LinReg) - Relative Expression Software Tool (REST)
双标记水解探针（TaqMan探针） • 特异性高 • 目的基因浓度低时结果可靠 • 需要设计探针及反应条件优化 • 目的基因较少时适用 • 成本较高
实时检测: SYBR® Green I
Excitation
5’
SG
SG
3’
Emission
SG
3’
SG
5’
SG
实时检测: SYBR® Green I