• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最 后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓 度进行定量分析的方法。
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TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
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PCR反应过程
• 93 ℃~98 ℃变性：加热使双链DNA变为单链。
• 37 ℃~65 ℃退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交 链 。 • 70 ℃~75 ℃延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以 引物为起始点的延伸反应。
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PCR技术原理
循环次数 1 21 DNA的链数 2
示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
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失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、 有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
平台期
线性增长期
指数增长期 基线期
阈值线
CT值 扩增曲线线性图谱： 横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）。
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PCR扩增曲线对数图
平台期 线性扩增期 指数扩增期 基线期
扩增曲线对数图谱： 横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）。
而增加。
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结果分析时的几个基本概念
基线（Baseline） 阈值线（Threshold） Ct值（Cycle threshold）
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基线
• 基线（Baseline）：扩增曲线中的水平部分。
调整原则：如果Ct值>18，不需调整，使用自动分析结果； 如果Ct值<18，修改终点，再分析一次； 起点一般取3~6，终点一般取12~15。
标本间的交叉污染：如在实验过程中，由于操作 不当，或者样本采集不当造成的交叉污染； 产物污染：通常指扩增产物泄漏导致的气溶胶污
染；
试剂污染：如在提取过程中或配制反应液时造成
了试剂污染，从而使得检测结果出现污染；
相关性）。
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PCR扩增的数学原理
理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+E)n
n: 扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产无量 X0：初始模板量 E：扩增效率
等式仅在限定的扩增指数增长期成立。超过此时期后， 扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平 台，不再扩增。
数据分析一般流程
定值浓度或Ct值
通过上述步骤分析后，可以得到一个比较
准确的定量结果或Ct值，如果在上述步骤
中没有记录到异常曲线或者情况，则可以 发出正确的报告，对于异常的曲线或者情 况，则需单独分析，确定复检的必要性。
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复检的一般情况-失控
阳性质控或阳性样本的失控
阴性质控或阴性样本的失控
2
3 10 20 30
22
23 210 220 230
4
8 1024 1,048,576 1,073,741,824 10亿
PCR特点：高效扩增、忠实复制
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PCR产物的电泳检测和分析
ladder
PCR fragment
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二、实时荧光定量PCR
(Real time Quantitative PCR)
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数据分析一般流程
数据分析三部曲
曲线分析（Amplification Plot）
标准曲线分析（Standard Curve）
定值浓度或Ct值
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
该步骤主要是对扩增曲线进行整体或单个的调整，
主要包括：对数曲线与线性曲线的转换、模板或
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对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与 目的基因的检测通道不同，因此需根据需 求选择不同的通道进行结果分析。
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失控的一般情况
阳性质控或样本失控的一般表现
阳性质控或者样本没有典型的扩增；
阳性质控Ct值或者定值偏差在±2SD之外
阳性质控或者样本扩增曲线异常，不呈典 型的“S”型，如直线倾斜扩增或者折线型；
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失控的一般情况
阳性质控或样本失控的一般原因
核酸提取中的随机误差：如核酸提取过程中的丢失、有机 溶剂的去除不彻底、标本中产生扩增抑制物的残留、所用 耗材存在PCR抑制物等； 仪器问题：如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所
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标准曲线分析
斜率、截距、相关性
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数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线 的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
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实时荧光PCR定量原理
k=-1/log(1+E)
Ct
Log C0 上图为外标定量方法原理图。
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 标准品与待测样本的扩增效率一致。
Log(浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作 出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中的起始模板量。
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实时荧光定量PCR简介、结果分析及 报告
广西临床检验中心 周向阳
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PCR技术简介
实时荧光定量PCR技术原理 实时荧光定量PCR结果分析 结果报告的要点分析
3
4
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（PCR：Polymerase Chain Reaction)
一、 多聚酶链式反应
1985年，Kary.B.Mullis教授发明了具有划 时代意义的PCR技术。 1993年， Kary.B.Mullis因该技术的发明而 获得诺贝尔化学奖。
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扩增曲线
S型曲线的四个特征性阶段
线性基线期：指PCR反应处于起始阶段。此阶段，扩增产物很少，所 产生的荧光信号很低，反应了系统背景情况。 指数增长期：指PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每一循环 后，PCR产物呈指数倍增加。 线性增长期：指PCR达到稳定的线性扩增阶段，PCR产物呈几何倍数增 加。 平台期：由于原料消耗殆尽，扩增减缓，荧光信号不再随循环数增加
内标检测探针的选择、基线的调整、阈值的设定
等几个方面。
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
对数曲线与线性曲线的转换：一般情况下，
我们对实验结果的分析都是在线性曲线基
础上进行的，因此在实验扩增结束后，需 先将对数扩增曲线转换为线性曲线，以便 于后续的分析。
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对数曲线与线性曲线的转换
目的基因：FAM 内标：HEX
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
基线的调整：其作用直观反应为曲线基线形状的高低或均 一性变化。通常情况下，选择自动分析，此时仪器会针对 每条曲线进行优化分析，因此效果通常比较好。在基线自 动分析的基础上，如果出现某些形状异常的曲线，则在其 他结果分析完成后，再单独对异常曲线进行手动基线调整 分析。
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
手动基线设定原则：1.基线的结束点应在进入线
性期的前几个循环；2.基线开始点应避开反应开
始时不稳定的几个循环；3.基线应选择比较平坦
的区域；4.基线设定以刚好超过正常阴性对照品
扩增曲线的最高点。
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自动基线与手动基线
Intercept（截距）：不同公司的试剂截距有很大的不同，主要是指只有1个 病毒扩增时，曲线出现的Ct值。 R2（线性相关性）：指示本次实验标准品的线性关系。 注：优质试剂的标准品每次实验的参数是比较稳定的，做质控分析后偏差应在 ±2SD范围内，Ct值变异系数应小于10%。
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标准品分析：观察标准品分布是否均匀，梯度是否正常，Ct值是否正
常；
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数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
该面板主要用于标准曲线参数的分析，通过对曲
线各个参数的统计，可以判断实验定量的准确程
度或者试剂的稳定程度。其主要包括三个参数：
Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（线性
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与普通PCR的区别
普通PCR 实时荧光定量PCR 开管操作、需要后处理、 闭管操作、无需后处理、避 易造成污染，假阳性率高。 免了污染，防止假阳性。 PCR结束后，对终点产物进 行分析，不能定量，重复 性差。 实时监测PCR扩增，在指数扩 增期对起始模板进行定量， 重复性好。