在基因数据库中，初步明确基因的编码序列，并可对其编码产物的基速扩增（RACE）技术是高效钓取未知基因编码序列的一种方法。
3. 用RNA剪接分析法确定基因编码序列
选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签（expression sequence tag, EST）的 比较进行鉴定。
基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导 入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的 表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因 功能。
方法： 转基因技术 基因敲入技术
1. 用转基因技术获得基因功能
转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精 卵或胚胎干细胞（embryonic stem cell），即ES细胞，通过随机重组 使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受 体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。
第二十五章
基因结构功能分析 和疾病相关基因克隆鉴定
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目录
第一节 基因结构分析 第二节 基因功能研究 第三节 疾病相关基因鉴定克隆原则 第四节 鉴定克隆疾病相关基因的策略和方法
重点难点
掌握 鉴度的技术及原理；分析表达产物的主要技术；基 因功能研究的方法技术。
转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培育出 的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基 因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和 鉴定、转基因动物品系的繁育等。转基因小鼠最为常见。
三、分析基因表达的产物可采用组学方法和特 异性测定方法
基因表达产物包括RNA和蛋白质/多肽，因 此分析基因表达可以从RNA和蛋白质/多肽水平 上进行。
(一）通过检测RNA而在转录水平分析基因表达
核糖核酸酶保护实验的原理
（二）通过检测蛋白质/多肽在翻译水平分析基因表达
u蛋白质印迹技术 u酶联免疫吸附实验 u免疫组化实验 u流式细胞术 u蛋白质芯片和双向电泳
片两大类。蛋白质检测芯片包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片 等，它是将具有高亲和力的特异性探针分子固定在基片上，用以 识别生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋 白质修饰、蛋白质-蛋白质∕蛋白质-DNA∕蛋白质-RNA，以及蛋白 质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、蛋白质-小分子等的相互作 用。
一、基因比对及功能诠释
重要的生物信息中心网址如下
数据库名称
数据库服务器网址
GenBank
/
GSDB
:80/gsdb
（Genome Sequence Database）
NDB

1. 用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽
2. 用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽
酶联免疫吸附实验（ELISA）也是一种建立在抗原 -抗体反应基础上的蛋白质/多肽分析方法，其主要用于 测定可溶性抗原或抗体。
3. 用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达的蛋白质/多肽
免疫组化实验包括免疫组织化学和免疫细胞化学实验，二 者原理相同，都是用标记的抗体在组织/细胞原位对目标抗原 （目标蛋白质/多肽）进行定性、定量、定位检测。
4. 用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞
流式细胞术（flow cytometry）通常利用荧光标记抗体 与抗原的特异性结合，经流式细胞仪分析荧光信号，根据细胞 表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞做出判断。
5. 用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质/多肽表达水平
（1）用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱 根据制作方法和用途不同，可将其分为蛋白质检测和功能芯
(二) 基因启动子结构分析技术
DNase I足迹法的原理
（三）基因转录起点分析技术
转录起点（transcription start site，TSS）
5’-RACE鉴定TSS的原理
二、检测基因的拷贝数是了解基因表达丰度的重 要因素
u DNA印迹是根据探针信号出现的位置和次数判断 基因的拷贝数 u 实时定量PCR是通过被扩增基因在数量上的差异推 测模板基因拷贝数的异同 u DNA测序是最精确的鉴定基因拷贝数的方法
目前可总结基因的主要生化功能如下
转录因子
核骨架蛋白
信号分子
酶
细胞骨架蛋白 膜受体
离子通道蛋白 转运体
激素
细胞因子
抗体
凝血因子
载体蛋白
胞外基质蛋白
常用的高通量筛查蛋白质间相互作用的方法是酵母双杂交技术和噬菌体展示技术
三、利用工程细胞研究基因功能
（一）采用基因重组技术建立基因高表达工程细胞系 （二）基因沉默技术抑制特异基因的表达
熟悉 疾病相关基因鉴定克隆原则；克隆疾病相关基因的 策略和方法。
了解 利用基因编辑技术鉴定基因功能。
第一节
基因结构分析
一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键
基因的顺式元件包括
u 基因编码区 u 启动子区 u 转录起始点的确定 u 其他顺式作用元件
(一)确定基因编码区分析技术
1. 用数据库分析基因编码序列
（Nucleic Acid D Database）
NCBI
/
SWISS-PROT
.swissprot/
PROSITE
http://www.expasy.ch/prosite/
二、基因发挥作用的本质是其生物化学功能
（2）用双向电泳分析蛋白质/多肽表达谱
双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质，对差 异表达的蛋白质进行鉴定。
第二节
基因功能研究
基因的功能实际是基因表达产物的功能，也就是 编码蛋白质功能和非编码RNA的功能，前者是本节讨 论的重点。
基因产物之一蛋白质的功能可以从三个不同水平来描述 l 生物化学水平 l 细胞水平 l 整体水平
四、利用基因修饰动物整体研究基因功能
尽管在体外对基因功能的研究可提供大量信息，但是只有 在整体内的研究才能真实反映该基因在体内的真正作用。
通过在实验动物，持别是小鼠体内进行相关的基因操作， 获得基因修饰动物品系，已成为在体研究基因功能的重要手段 ，常用的有转基因动物和基因敲除动物。
（一）用功能获得策略鉴定基因功能