DNA分子标记技术及其应用摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。
本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。
最后探讨了其进展以及存在的一些问题。
关键词：分子标记；应用分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。
与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。
这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。
1DNA分子标记的概念遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。
从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。
前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。
与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。
这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。
目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。
2分子遗传标记技术的种类2.1RFL P标记RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。
它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。
这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。
其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。
与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点:(1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；(2)RFL P标记等位基因间是共显性的,非等位基因间不存在上位效应,互不干扰；(3)REL P起源于基因组DNA的自然变异,这些变异在数量上几乎不受限制,可以选取足够数量能代表整个基因组的RFL P标记。
RFLP标记正因为具有这些优点，其特别适用于构建遗传连锁图,在进行群体内和群体间的遗传变异度分析、群体间基因流的评价以及谱系亲缘关系分析时是强有力的工具。
2．2RAPD技术RAPD(Randem amplified polymorphic，RAPD是随机扩增多态性DNA)标记，是由美国科学家Willians等发展起来的,是以PCR为基础的一项分子标记技术。
它主要是以人工合成的随机寡聚核苷酸序列为引物,通常为10个碱基,利用PCR技术随机扩增基因组DNA模板的不同位点,得到一系列多态性DNA片段。
扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离,经EB染色后,即可进行多态性分析。
RAPD标记与其它分子标记相比,其优点主要表现在:（1）RAPD技术可以在对物种缺乏分子生物学研究资料的情况下,对其进行DNA多态性分析；（2）RAPD 引物可用于不同生物基因组多态性的研究。
因此,RAPD引物可以在规模生产形成商品,这大大降低了研究费用。
RAPD标记也有不足的一面,它为显性标记,检测的变异来源不清,也不能判断多态的DNA片段为纯合子还是杂合子;此外,RAPD 标记的重复性常受实验条件的影响。
2．3AFLP技术扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFL P)标记是Zabeau等于1992年发明的一项专利技术。
它是以PCR为基础的RFLP技术，基因组DNA经2个限制性内切酶酶切后(通常一个酶切点数多，另一个酶切点数较少)，与特定接头相连接,根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行特异性PCR扩增，最后分离扩增的DNA片断。
AFLP既具有RAPD快速高效的特点,又具有RFLP稳定可靠、重复性好的特点,同时由于AFLP采用的专用引物3’端选择碱基数目和序列是随机的,故能提供比两者更多的DNA多态性信息,AFLP技术是一种功能强大但是技术难度最高的分子标记。
2．4STS技术STS(Sequence-Tagged Sites，序列标记位点)标记是一种等位点的标记,在不同基因组间具有特异性,它是将RFLP标记技术转化为基于PCR的方法,通过设计一对长度约20bp的特异引物,对基因组DNA进行扩增。
该方法在设计引物时需要测序,但是,一旦获得引物,STS法就变得和RAPD一样简单、迅速。
2．5SSR技术SSR(Simple-Sequence Repeat,简单重复序列)标记,又称微卫星(microsatellite)标记,是利用特异引物扩增在植物基因组存在的由1～4个碱基组成的简单重复序列(SSR)等。
由于微卫星的寡核苷酸的重复次数在同一种物种不同基因型个体之间差异性很大,多态性检出率高,而且操作简单,结果稳定可靠。
所以,这一技术很快就发展为一种新的分子标记法,并在人类和小鼠中构建了以微卫星为主的遗传连锁图。
2．6SNP标记SNP(Simple Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)标记，被称为“第三代DNA遗传标记”，是直接以序列的变异作为标记的一种DNA分子标记。
单核苷酸多态性是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。
它是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态性。
在大多数基因组中存在较高的频率,在人类基因组中平均每113kb就有一个SNP存在。
这种类型DNA多态性仅有两个等位基因的差异,所以它的最大杂合度为50%。
SNPs提供的信息量远小于常用的遗传标记,但它的数量丰富,最大的优点在于它可实现自动化检测,因此,SNP具有广泛的应用前景。
目前,检测SNP标记最常用的方法有两种:随机扩增DNA(RAPD)法和DNA芯片(DNA chip)检测法。
3DNA分子标记技术的应用3.1分子遗传图谱的构建目前几乎所有重要农作物,如水稻、番茄、玉米、小麦、大豆、马铃薯、棉花、油菜等的RFLP图谱均已构成,随着多种标记的不断添加与定位,分子遗传图谱正日渐趋于饱和。
3.2遗传多样性分析分子标记广泛存在于基因组DNA的各个区域,数量巨大,通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较,就能够全面评估研究对象的多样性,并揭示其遗传本质。
利用遗传多样性的结果可以对种质进行聚类分析,了解其系统发育与亲缘关系。
以分子标记为基础的比较基因组研究则有利于探明近缘物种间的遗传同源性以及物种起源等生命科学领域中的重要问题。
3.3重要农艺性状基因定位遗传连锁图谱对于基因定位至关重要,图谱上包括的标记数越多,分布越均匀,则基因定位就越精细。
建立起完整的高密度分子图谱,就可以定位感兴趣的基因,特别是控制数量性状的基因。
3．4分子标记辅助选择育种MAS是借助与目标基因紧密连锁的标记基因型分析,选择分离群体中含有目标基因的个体,从而加速育种过程。
MAS主要应用于3个方面:(1)在转移外源种质有利基因、改良现有栽培品种的育种中,MAS多应用于回交育种。
把外源基因回交导入栽培种中,并作标记分析,有可能改良一些过去由于缺乏足够的遗传变异而很难改良的性状。
(2)利用与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记可进行基因聚合,将数个基因聚合到一个品种中,突破回交育种改良个别缺点或某个性状的局限,使品种在多个方面同时得到改良。
(3)MAS应用于数量性状改良可大大提高选择的效率。
3.5种质鉴定分子标记可用于鉴别品种的混杂情况和真假杂种等。
我国彭锁堂等利用SSR 分子标记技术,成功地对杂交稻组合及其亲本进行纯度鉴定,所测纯度与田间鉴定结果非常接近。
4结语DNA分子标记技术的开发虽然只有短短20年左右的历史,但已取得了巨大的进展。
分子标记技术的广泛应用最重要的影响因素是成本与效益。
随着分子标记技术的发展,它已接近程序化而变得易于实施。
但在实践中还有许多问题急需解决，例如如何采用更易为育种家们接受的简便、实用的分子标记(SSR、RAPD等)来构建新的连锁图,更多重要农艺性状基因的精细定位、检测过程自动化的实现、分子标记技术与常规育种经验的结合等。
我们相信,随着这些问题的圆满解决,DNA分子标记技术必然会有突破性的进展。
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