细胞学标记
植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染 色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等） 和带型（C带、N带、G带等）的变化。
优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色 体区域定位
缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长 时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细 胞学方法进行检测
生化标记
主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从 组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法 将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影 响较小
缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相 当有限; (2)有些酶的染色方法和电泳技术有一 定难度
分子标记
主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种 差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA 间的差异，也叫DNA标记。
2/片段迁移率的变化要反映分子量的差异 ————DNA在聚丙烯酰胺凝胶上迁移率也受构象 变化影响
RFLP 基 本 步 骤

RFLP patterns in Pinus densata
RFLP
优点: 无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响
共显性，非常稳定 起源于基因组DNA自身变异，数量上几乎不受限制
分子标记技术原理、方法 及应用
黄健子 2011.10
一、遗传标记的类型及发展 二、几种常见分子标记的原理及方法 三、分子标记技术的应用
一、遗传标记的类型及发展
遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染
色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一 种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和 可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变 型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标 记、生化标记和分子标记四种类型。
RFLP
PCR-RFLP
➢ 实验流程
➢ DNA提取 ➢ 目的片段扩增(nrDNA, cpDNA or mtDNA 1–3kb) ➢ 限制性内切酶消化 ➢ 电泳分离 ➢ EB染色或银染
RFLP
BspI RsaI HincII
PCR-RFLP
ScaI MboII RsaI
Identification of rice genomes by PCR-RFLP of Adh genes
几种主要的ＤＮＡ分子标记
英文缩写 RFLP STS RAPD AFLP SSR SNP
英文名称
Restriction fragment Iength polymorphism
Sequence tagged site
Random amplified polymorphic DNA
Amplified frangment length Polymorphism
(1)数量多，高多态性，信息量大 (2)与生长发育无关，取材不受限制 (3)能明确辨别等位基因 (4)均匀分布于整个基因组 (5)选择中性，不影响目标性状的表达 (6)检测手段简单、快速 (7)成本低廉 (8)稳定，重复性好 (9)共显性遗传
在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经 发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技 术大致可以分为三大类：
缺点：检测步骤多，周期长，需DNA量大，费时
用作探针的DNA克隆制备、保存不方便 放射性同位素，易造成环境污染
自从人的RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、 大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。
RFLP
显性标记 or
共显性标记
RFLP
RFLP研究的发展
酶 基因组DNA
切
对
象
PCR产物
RFLP PCR-RFLP
Simple sequence repeat
Simple mucleotide polymorphism
中文名称 限制性片段长度多态
性 序列标签位点 随机扩增多态性DNA
扩增片断长度多态性
简单序列重复 单核苷酸多态性
二、几种常见分子标记的原理及方法
1.RFLP 2.RAPD 3.AFLP 4.SSR 5.ISSR 6.SNP
形态学标记
主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、 紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖 特性、抗病虫性等有关的一些特性。
优点: 形态学标记简单直观、经济方便 缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2) 多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标 记与不良性状连锁; (4)形态标记的获得需要通 过诱变、分离纯合的过程，周期较长
用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的DNA分子 上，内切酶的识别序列有差异，即是由限制性酶切位点上 碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反 映在酶切片段的长度和数目上。
RFLP 分 子 基 础
RFLP
两个假设：
1/片段式样的变化由任一序列突变引起 ————DNA序列甲基化会造成酶切位点得失的假 象
第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA 指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记； 第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性 RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序 列标签位点STS等，为第二代分子标记； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标 签EST标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism by Botstein(1980)
基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下， 产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的 DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从 而构建出多态性图谱。
Ge et al. 2001. Genome 44: 1136-1142
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA by Williams et al.(1990)
基本原理：此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有 10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进 行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反 向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一 引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩 增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间 DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和 长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过 EB染色以检测DNA片段的多态性。