44茶　叶　通　讯2002年 收稿日期:2002茶叶水解酶的研究进展唐　颢 杨伟丽(湖南农业大学茶学系·长沙·410128)摘　要　本文简述了近二十年来国内外茶叶中水解酶的研究及应用情况,并展望了其今后的研究方向和应用前景。

关键词　茶叶;水解酶;固定化;增质效果 水解酶是催化水解反应的一类酶,茶叶中研究得比较多的水解酶主要有果胶酶、纤维素酶、糖苷酶、蛋白酶和淀粉酶等。

茶叶加工实质上是一个生物化学和物理化学的过程,其主要技术环节都与酶的控制和利用有关[1]。

许多研究表明,水解酶与茶叶中的可溶性糖、氨基酸及醇类香气物质等的形成关系密切。

因此,研究水解酶在茶叶加工过程中的作用机理和活性变化动态,对于提高茶叶及茶饮料的香味品质具有重大的理论和实践意义。

随着酶学的进展,茶叶中的酶学研究也在逐步深入和系统化。

本文就近二十年来国内外茶叶水解酶的研究状况作一综述。

1　水解酶的研究概况1.1　糖苷酶随着茶叶香气研究的不断深入,茶叶内源水解酶作为与茶叶醇类香气物质的形成密切相关的酶类而倍受关注。

自20世纪80年代以来,国内外对茶叶内源及外源糖苷酶陆续进行了深入的研究。

(1)β—葡糖苷酶。

自然界许多植物籽实内部存在β—葡萄糖苷酶。

它还存在于一些酵母、曲霉菌和木霉菌属及细菌体内[2]。

人们最初是在甜杏仁中发现了这种酶,称之为“杏仁酶”。

直到今天,人们主要还是从杏仁中获得这种酶。

β—葡萄糖苷酶不仅可水解纤维二糖和寡糖,而且可解除纤维二糖对β—1,4—内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制,提高水解速率和程度。

茶叶中的糖苷酶研究始于20世纪80年代初期,Takeo.T[3](1981)在去除挥发物的蒸青茶鲜叶匀浆中加入外源β—D—葡萄糖苷酶共同培养,结果发现有大量的芳樟醇和香叶醇生成。

随后,他又将茶鲜叶匀浆物置40℃下培养30min后同样发现有大量的芳樟醇和香叶醇产生,当加入β—葡萄糖苷酶的抑制剂Hg+和特异性抑制剂葡萄糖酸—1,4—内酯后,芳樟醇和香叶醇的生成受阻。

他据此推测茶叶中芳樟醇和香叶醇的形成与内源β—葡萄糖苷酶有关,这是茶叶香气水解酶研究的开始。

Fischer N.等[4] (1987)用外源β—葡萄糖苷酶及果胶酶水解红、绿茶,产生大量香气物质。

进一步说明β—葡萄糖苷酶能促使茶叶香气物质的释放。

Yano M[5]等(1990)以对硝基苯—β—D—葡萄糖苷为底物,同茶叶粗酶提取物共同培养后,测出每100g茶鲜叶中含有20.8个活性单体的β—葡糖苷酶。

这不仅支持此前Takeo T.的推论,也首次证实茶叶中含有参与香气释放的β—葡糖苷酶。

之后,Sakata K.等[6] (1993)将茶鲜叶粗酶提取物纯化后得到β—D—半乳糖苷酶和β—葡萄糖苷酶,更有力地证明了茶叶中存在参与香气释放的β—葡萄第2期唐　颢、杨伟丽:茶叶水解酶的研究进展45糖苷酶。

β—半乳糖苷酶广泛存在于植物中,并参与植物细胞壁多糖及阿拉伯半乳聚糖的降解。

但是,目前尚未有直接证据证明β—半乳糖苷酶参与了茶叶的香气释放,也没有发现以半乳糖为糖基的香气前体。

此后,对β—葡萄糖苷酶的研究逐步深入,董尚胜等[7] (1998)试验证明茉莉花中的β—D—葡萄糖苷酶能催化生成芳樟醇,并初步判断其等电点在8.7～9.0,其单体蛋白分子量在35～38KD之间。

夏涛等[8](1998)研究了红茶萎凋过程中β—葡萄糖苷酶活性的变化动态,结果表明:在萎凋期间,酶活性是逐步增强的,其活性可达鲜叶的2～ 2.5倍,且受萎凋温度和萎凋程度的影响;而在发酵过程中该酶活性迅速下降,且发酵温度越高,其活性下降越大。

据此他认为低温萎凋和发酵有利于酶活性的提高和香气的形成。

张秀云等[9] (1999)采用不同做青工艺,对福鼎大白茶的槠叶群体种两品种萎凋做青过程中β—葡萄糖苷酶活性的变化进行了研究。

结果发现,萎凋做青期间酶活性呈双峰变化趋势,做青结束前约2h达整个做青过程的最大值;重做青比轻做青酶活性高,槠叶种比福鼎大白茶的酶活性高。

并认为在不同的茶区应采用合适的做青方式(重、轻做青),才能充分发挥乌龙茶的特征性香气。

骆耀平[10]等对适制红茶、绿茶、乌龙茶的7个茶树品种新梢中β—葡萄糖苷酶的活性进行了研究。

结果发现,7个品种间的β—葡萄糖苷酶活性差别甚大,高低之差达3～4倍。

同时,新梢不同叶位的酶活性是:芽>第1叶>第2叶>第3叶>茎梗,随叶龄的增加该酶活性趋于减弱,但有的品种呈先降后升的变化。

江昌俊[11]研究了β—葡萄糖苷酶的活性的茶树芽叶中的日变化,试验结果表明,一天内茶芽叶中的β—葡糖苷酶活性表现出两个高峰,即在中午12: 00左右达到最高峰,然后下降;下午4:00左右酶活性再次上升,18:00～20:00酶活性达到次高峰,随后缓慢下降;次日凌晨0:00～2:00酶活性最低,尔后缓慢上升。

这表明酶活性日变化与温度、光强及空气相对湿度等生态因子的日变化无明显关系。

准确测定β—葡萄糖苷酶的活性是研究其在制茶过程中的变化规律和机理的前提。

王华夫等[12]以对硝基苯基—β—D—葡萄糖苷(pN PG)为底物,研究了茶叶中β—葡萄糖苷酶的活性,并建议选择400nm测定其吸光度。

江昌俊等[13,14]研究了茶树鲜叶提取β—葡萄糖苷酶时不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PV PP)的加入量、缓冲液的选择和多酚类浓度等对酶活性的影响及酶的部分特性。

结果表明:加入与鲜叶重量相等的PV PP可获得较高的酶活性,选用浓度为0.1mol/l(离子强度为0.7)的柠檬酸钠缓冲液可获得较高活性的酶液;浓度仅为4mg/l的茶叶多酚类物质能使酶完全失活;β—巯基乙醇和ED-T A对酶活性有抑制作用;而甘油能提高酶活性,且2～ 2.5mol/l的甘油效果较明显; Na Cl对酶活性几乎没有影响。

舒爱民[15]研究了β—葡萄糖苷酶的固定化及其性质,发现β—葡萄糖苷酶经壳聚糖固定化后,酶促反应的最适温度从40℃提高到50℃,高活性的温度范围相应增大(40℃～60℃);酶促反应的高活性p H范围也加宽到(5.0～ 6.5);室温条件下储存酶活力稳定性得到极大改善。

这些性质的改善将有利于酶制剂应用于饮料生产实践,对利用β—葡萄糖苷酶水解释放茶叶饮料中的香气成分,改善茶饮料的风味和品质尤其有利。

(2)β—樱草糖苷酶。

茶叶中含有多种糖苷酶。

随着研究工作的不断深入,越来越多的糖苷酶相继被发现。

M orita K.等[16](1994)将茶鲜叶中制备的粗糖苷物质分别同四种酶制剂共同培养,实验结果显示,β—葡糖苷是茶叶中香气前体的主要存在形式;糖苷酶和茶鲜叶丙酮粉处理后,释放的香气物质量几46茶　叶　通　讯2002年乎是β—葡糖苷酶处理的2～3倍,这说明茶叶中香气前体除了葡糖苷形式外,还以其他单糖苷、双糖苷或寡糖苷形式存在,相应参与香气释放的内源酶也具有多样性。

Guo W.等[17]、Og aw a.K等[18]及Yasuy uki Ljima 等[19]分别从薮北种、水仙种及阿萨姆种茶鲜叶粗酶提取物中经层析纯化得到β—樱草糖苷酶,进一步探明了参与香气释放的内源酶系。

Og awa.K用中国水仙和毛蟹品种制成乌龙茶,提取其粗酶和香气物质,测定了樱草糖苷酶的活性及其特性。

测得其分子量分别为6.1Kd和 6.03Kd,其等电点为9.5,最适温度为45℃,最适p H为 4.0。

该酶在45℃以下,p H3.0～ 5.0时表现稳定。

将该酶与糖苷结合的前体反应时,检出大量释放的芳樟醇及其氧化物、香叶醇和α—苯乙醇等。

他指出,不同茶树品种中,存在相同的配质,但是具有不同的糖苷及其相应的酶类。

该结果对选育茶树新品种,提高茶叶品质,具有重要意义。

Dey P.M[20]采用Ko ening kno rr反应,合成了芳樟醇及其氧化物(LOⅠ、LOⅡ、LO Ⅲ和LOⅣ)的β—D—葡糖苷以及苯甲醇、α—苯乙醇、香叶醇和ρ—硝基苯酚和β—樱草糖苷等化合物,并采用1H—N M P和13C—N M P验证了合成化合物的结构。

使用这些合成的苷做底物,研究了茶树叶片中糖苷酶的活性。

结果发现,对糖基而言,水解活性以β—樱草糖苷酶方向最高,几乎是β—D—葡糖苷的两倍,这与Sa taka.K等人报道的β—樱草糖苷酶是茶叶中的主要糖苷糖的研究结果相一致。

因此,茶叶中的β—樱草糖苷被认为是香气形成的主要底物。

1.2　纤维素酶和果胶酶纤维素酶和果胶酶属于多糖水解酶类,可催化纤维素和果胶物质水解成小分子的糖类物质,从而增加茶汤的甜醇度。

纤维素酶是协同作用的多组分酶系,目前发现纤维素酶中有三类性质不同的酶,即C1酶、β—1,4—葡聚糖酶(亦称C X酶)和β—葡萄糖苷酶(亦称纤维二糖酶),其中,C1酶是纤维素酶的重要组分,是对纤维素最初作用的酶[2]。

茶叶中的纤维素酶和果胶酶的研究未见报道,只是纤维素酶组分之一的β—葡萄糖苷酶作为重要的香气水解酶颇受关注。

由于添加酶制剂对食品、饮料有着显著的增质效果,故不少的研究集中于外源纤维素酶和果胶酶制剂的茶叶加工和茶饮料生产中。

谭淑宜等[21]发现,添加0.3%的纤维素酶可使红茶水浸出物的提取率提高20%左右,并可改善提取液的品质。

包先进等[22]在渥堆砖茶湿坯中添加纤维素酶,结果缩短了发酵时间,并使砖茶水浸出物和可溶性糖的含量有较大幅度的提高,发展了香气,从而改善了砖茶的品质。

钱晓军等[23]研究发现绿茶、乌龙茶和红茶的水浸出液经果胶酶处理后,其超滤通量都有不同程度的提高,其中绿茶和乌龙茶的提高较明显。

各茶叶的浸出液经果胶酶酶解后,感官品质基本上没有变化,茶多酚、氨基酸等主要成分的变化也不显著。

由此可见,果胶酶在茶浸出液的膜分离中的应用非常有前景。

此外,Fischer[4]研究发现,在绿茶罐装茶水中加入果胶酶,可释放出大量的香气物质芳樟醇和香叶醇,说明在茶饮料加工中添加适量的果胶酶可改善其香气品质。

日本报道[24],在生产速溶红茶时,将茶叶与单宁醇和纤维素酶液按适当比例混合后25℃加热提取2～3h小时,结果可使其可溶性固体分较对照由 2.59%提高至 3.30%,萃取率由22.2%上升到30.4%,冰水中不溶物由9.09%降低到0.0%。

毛清黎等[25]根据微生物生理生态学原理,利用国际公认的安全菌种(GRAS)从液体、固体发酵及抗酚性等方面探讨了适于制茶用的多糖水解酶发酵生产方法及酶法制茶效果的大生产试验。

结果显示,在果胶酶的液体发酵生产中,发酵液中的还原糖对果胶酶的产生有抑制作用;固体发第2期唐　颢、杨伟丽:茶叶水解酶的研究进展47酵的多糖水解酶活性及产率比液体发酵高。

这些研究为今后外源水解酶在食品、饮料工业中的实际应用开辟了道路。

1.3　蛋白酶蛋白酶可将茶叶中的蛋白质水解成各种氨基酸,不仅能改善茶叶的香气和鲜爽度,而且可减少不溶性的复合物产生,提高茶汤的质量。