肉苁蓉苯乙醇苷乙醇回流提取影响因素研究吴海虹1,玄国东2,刘春泉1(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;2.山东省产品质量监督检验研究院,山东济南250100) 摘要:以松果菊苷为标准品,采用紫外分光光度法测定了盐生肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的含量,同时对影响肉苁蓉苯乙醇苷乙醇回流提取的反应温度、乙醇体积分数、料液比、提取时间以及提取次数等5个因素进行了分析,确定了较佳工艺条件。
结果表明,肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的较佳提取条件为温度70℃,料液比1∶10,乙醇体积分数80%,提取时间2h,提取次数2次。
关键词:肉苁蓉;苯乙醇苷;影响因素;提取工艺 中图分类号:R284.1 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2009)01-0250-03收稿日期:2008-11-25基金项目:江苏省农业科学院科研基金(编号:6510605)。
作者简介:吴海虹(1976—),女,江苏仪征人,硕士,研究方向为天然产物研究与开发。
E -mail:wuhaihong169@ 。
通讯作者:刘春泉,研究员。
Tel:(025)84391255;E -mail:lcq@jaas .ac .cn 。
肉苁蓉属多年生根寄生草本植物,是名贵中药材,具有补肾、益精、润肠、抗衰老等功效,由于生长于沙漠环境,又有“沙漠人参”之美誉。
国内外学者对肉苁蓉的化学成分进行了大量研究,迄今为止,已经分离出约近70种化合物,包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类化合物以及生物碱和糖类等其他成分[1]。
其中最主要成分为苯乙醇苷类化合物,以β-葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键的天然糖苷,广泛存在于双子叶植物中,是由苯乙基、咖啡酰基和多个糖基组成的一类分子量较大、结构相似的水溶性物质[2],根据其取代基的不同,可分为肉苁蓉苷(A 、B 、C 、D )、类叶升麻苷、松果菊苷等[3]。
Sat o 等[4]药理学研究证明,类叶升麻苷、肉苁蓉苷A 和C 、松果菊苷等能显著提高小鼠的性功能,并能增强记忆力。
本试验通过对盐生肉苁蓉苯乙醇苷乙醇回流提取的影响因素进行分析,找出了苯乙醇苷类化合物的较佳提取条件,为苯乙醇苷类化合物开发利用提供一定的科学依据。
1 材料与方法1.1 材料、试剂与仪器材料:盐生肉苁蓉,内蒙古磴口县产。
试剂:松果菊苷标准品(中国药品生物制品检定所,纯度≥99%);D101型大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂);甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯等均为国产分析纯。
主要仪器:T U -1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);F W -100高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司);F A2104型电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司);标准分样筛(浙江上虞道墟路达仪器厂);HH -S 恒温水浴锅(江苏金坛恒丰仪器厂);YXJ -A 高速大容量电动离心机(江苏金坛环宇科学仪器厂)。
1.2 试验方法1.2.1 原料的预处理 将烘干的肉苁蓉进行粉碎,粉碎粒度为40目,备用。
1.2.2 松果菊苷测定波长的选择 称取松果菊苷1.5mg,置于50m l 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,在波长为230～450n m 范围内进行紫外扫描。
如图1所示,在波长为270～400n m 范围内,松果菊苷均有紫外吸收,其中338n m 处紫外吸收值最高,因此在试验研究中选定该波长进行松果菊苷标准曲线的绘制。
1.2.3 标准曲线绘制 称取松果菊苷标准品20mg,置50m l容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀。
分别吸取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0m l 置于25m l 量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。
以甲醇作测定空白,在338n m 波长测定紫外吸收度(图2)。
经线性回归处理得标准曲线:y =46.785x +1.1447。
在该方程中,x 表示吸光度值(OD 值),y 表示松果菊苷含量(μg/m l )。
该方程的回归系数r =0.9996,说明自变量与因变量之间存在高度的相关关系,—052—江苏农业科学 2009年第1期可以作为松果菊苷的标准曲线使用。
1.2.4 样品测定 称取肉苁蓉样品10.00g(共4份),用70%乙醇回流提取3次,乙醇用量分别为30m l、20m l、20m l,每次1.5h。
合并提取液,减压回收乙醇,膏状物用水10m l 混合,用水饱和的乙酸乙酯脱脂3次(每次乙酸乙酯用量为10m l),水层再用水饱和的正丁醇萃取3次(每次正丁醇用量为10m l)。
合并3次正丁醇萃取液,减压回收正丁醇,所得稠膏用水5m l溶解,加入装有15m l的D101的大孔树脂柱顶端,分别用水50m l、甲醇50m l洗脱,收集甲醇洗脱液45m l,并用甲醇定容至50m l。
精密吸取0.2m l,甲醇定容至25m l,摇匀,在338n m处测定吸收值,按松果菊苷回归方程计算含量。
1.2.5 肉苁蓉苯乙醇苷乙醇回流提取影响因素研究1.2.5.1 反应温度对肉苁蓉苯乙醇苷提取效果的影响 称取5.0g肉苁蓉干粉,加入70%乙醇溶液70m l,于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃恒温加热回流提取2.0h,提取液经浓缩分离之后,测定苯乙醇苷类化合物的含量。
1.2.5.2 乙醇体积分数对肉苁蓉苯乙醇苷提取效果的影响 称取5.0g肉苁蓉干粉,分别加入70m l体积分数为50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液,于70℃恒温加热回流提取,提取时间及浓缩分离方法同上,测定苯乙醇苷类化合物的含量。
1.2.5.3 料液比对肉苁蓉苯乙醇苷提取效果的影响 称取5.0g肉苁蓉干粉,分别按料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入体积分数70%的乙醇70m l,提取时间及浓缩分离方法同上,测定苯乙醇苷类化合物的含量。
1.2.5.4 提取时间对肉苁蓉苯乙醇苷提取效果的影响 称取5.0g肉苁蓉干粉,分别加入体积分数为70%的乙醇70 m l,并于70℃恒温加热回流提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h,浓缩分离方法同上,测定苯乙醇苷类化合物的含量。
1.2.5.5 提取次数对肉苁蓉苯乙醇苷提取效果的影响 称取5.0g肉苁蓉干粉,分别加入体积分数为70%的乙醇70 m l,并于70℃恒温加热回流提取2h,提取次数分别为1次、2次、3次、4次,合并提取液,浓缩分离方法同上,测定苯乙醇苷类化合物的含量。
2 结果与分析2.1 反应温度对苯乙醇苷类化合物提取效果的影响如图3所示,在反应温度为40～70℃范围内,随着反应温度升高,提取液中苯乙醇苷类化合物浓度也增加,浓度范围为30.19～32.91μg/m l,变化比较小,说明在该温度范围内,反应温度对苯乙醇苷类化合物提取的影响不明显。
但反应温度超过70℃之后,随着反应温度升高,提取液中苯乙醇苷类化合物浓度降低。
说明反应温度超过70℃之后,不利于苯乙醇苷类化合物提取。
综合考虑各个因素之后,认为选择反应温度70℃比较适合。
2.2 料液比对苯乙醇苷类化合物提取效果的影响图4显示,在反应料液比为1∶6～1∶14的范围内,随着料液比的提高,提取液中苯乙醇苷类化合物浓度也增加,但在1∶6～1∶10的范围内提取液中苯乙醇苷类化合物浓度增加比较迅速,浓度为21.8～31.93μg/m l;当料液比超过1∶10之后,提取液中苯乙醇苷类化合物浓度增加较缓慢,至料液比为1∶14时,苯乙醇苷类化合物浓度为34.18μg/m l,仅增加2.25μg/m l。
该结果说明,比较适合的料液比应大于1∶10,但考虑到提取溶剂的用量及成本因素,认为料液比选择1∶10比较适合。
2.3 乙醇体积分数对苯乙醇苷类化合物提取效果的影响图5显示,在乙醇体积分数为50%～80%范围内,随着乙醇体积分数提高,提取液中苯乙醇苷类化合物浓度也增加,浓度范围为27.72～32.44μg/m l,且在该范围内提取液中苯乙醇苷类化合物浓度的增加不明显,说明乙醇体积分数为50%～80%对苯乙醇苷类化合物提取效果的影响不明显。
乙醇体积分数超过80%之后,提取液中苯乙醇苷类化合物浓度开始下降,至乙醇体积分数为95%时,提取液中苯乙醇苷类化合物浓度下降至18.27μg/m l,说明乙醇体积分数超过80%之后对苯乙醇苷类化合物提取效果的影响比较大。
因此,乙醇体积分数选择80%比较适合。
2.4 提取时间对苯乙醇苷类化合物提取效果的影响由图6可见,反应时间为1～4h范围内,随着反应时间延长,提取液中苯乙醇苷类化合物浓度也增加,浓度范围为32.25～35.91μg/m l,在整个反应时间范围内提取液中苯乙醇苷类化合物浓度增加幅度很小,波动幅度仅为3.66μg/m l。
说明当提取反应超过1h之后对苯乙醇苷类化合物—152—吴海虹等:肉苁蓉苯乙醇苷乙醇回流提取影响因素研究提取效果的影响不大,因此,比较适合的提取时间为2h 。
2.5 提取次数对苯乙醇苷类化合物提取效果的影响由图7可见,在提取次数为1～4次范围内,随着提取次数的增加,提取液中苯乙醇苷类化合物浓度增加比较显著,浓度范围为31.55～52.29μg/m l,增加幅度为20.74μg/m l 。
说明提取次数对苯乙醇苷类化合物提取效果的影响比较大,但过多的提取次数将消耗很多时间及能源,综合考虑认为比较适合的提取次数为2次。
3 结论盐生肉丛蓉经乙醇回流提取、浓缩、乙酸乙酯脱脂和正丁醇萃取有效成分等步骤,再经大孔树脂D101吸附,甲醇洗脱,采用紫外分光光度法测定肉丛蓉中苯乙醇苷类化合物的含量。
经线性回归处理得标准曲线为y =46.785x +1.1447。
在该方程中,x 表示吸光度值(OD 值),y 表示松果菊苷含量(μg/m l )。
该方程的回归系数为0.9996,说明自变量与因变量之间存在高度的相关关系,可以作为松果菊苷的标准曲线使用。
对肉苁蓉苯乙醇苷回流提取影响因素的试验研究表明,反应温度选择70℃、乙醇体积分数选择80%、提取料液比选择1∶10、提取时间选择2h 、提取次数选择2次,比较适合。
参考文献:[1]刘秀华,李 芸,张 晶.肉苁蓉属植物的化学成分研究进展[J ].兰州医学院学报,2004,30(3):96-97.[2]靖 会,佐建锋,李教社.苯乙醇苷类化合物的药理研究进展[J ].时珍国医国药,2006,17(3):440-441.[3]宋志宏,屠鹏飞,赵玉英.管花肉苁蓉的苯乙醇苷成分[J ].中草药,2000,31(11):808-810.[4]Sat o A ,Kozi m a S,Kobayashi K .Phar macol ogical studies on cistan 2chis herba .ⅠEffects of the constituents of cistanchis herba on sex and learning behavi or in chr onic stressed m ice [J ].YakugakuZasshi,1985,105(12):1134-1137.欢迎订阅2009年《江苏农业科学》 邮发代号:28-10《江苏农业科学》是由江苏省农业科学院主办的综合性农业科技期刊,为双核心期刊(中国科技核心期刊、全国中文核心期刊),荣获第三届国家期刊奖提名奖、第二届国家期刊奖百种重点期刊奖、全国优秀科技期刊、江苏省双十佳期刊、江苏省优秀期刊、全国农口学会优秀期刊、华东地区优秀期刊等。