分子诊断的临床应用基因分析，即基因诊断 ( Gene Diagnosis )：是利用DNA 分析技术直接从基因水平 ( DNA or RNA ) 检测遗传病的基因缺陷。

这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直接从基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测基因的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方式，所以又称为逆向诊断 ( Reverse Diagnosis )。

基因诊断的优点：材料容易获得，不受细胞类型的限制；不受基因表达的时空限制。

不受年龄的限制；可以于发病前做出诊断；方便有效，迅速准确，携带者也可以有效检出。

基因诊断的难点：对大多数疾病尚未找到合适的基因诊断方法，另外由于遗传异质性、基因突变的多样性，一种基因诊断方法对同一疾病往往有很大差异。

基因诊断的对象：一般是指单基因病和某些有主基因改变的多基因病。

至1997年，发现人类单基因病遗传病已达8587种，现已达到15988种进行基因诊断必须具备的条件：(1)致病基因的染色体定位已明确(2)致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚(3)致病基因与DNA多态存在连锁关系根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术基因诊断方法目前常用的基因诊断方法:(1)聚合酶链反应DNA扩增法(2)限制性酶谱Southern印迹杂交直接分析法(3)限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析法(4)寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)检测法(5)DNA测序(6)基因芯片一、基因检测在感染性疾病中的应用（一）肝炎病毒基因的检测1、临床价值主要体现在：病情评估血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。

疗效预测治疗前病毒核酸载量越高，疗效越差；载量越低，机体清除病毒的可能性越大。

预后判断病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。

垂直传播途径感染者，预后较差。

反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸水平经常波动者更易发展为肝硬化。

2、乙肝HBV-DNA定量检测的临床诊断意义荧光定量PCR:为乙肝病毒的检测诊断提供了新手段，大量临床标本测定结果证明，其特异性为100％，灵敏度可达0.01fg（10-12mg），相当于2.5个乙肝病毒颗粒。

荧光定量PCR对下列情况更具有独特的诊断价值：1）.治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择对症药品，避免盲目用药。

2）.治疗后定量PCR可直接准确地测定体内病毒数量，有助于疗效的判断。

3）.怀孕前进行定量PCR测定，有助于选择有利的怀孕时机。

乙肝孕妇进行定量PCR检查，有助于使部分病人得到及时、正确的诊断。

所以说HBV-DNA定量检测指标降低在乙肝治疗中有着非常重要的意义，是乙肝转阴的前奏，也是康复最为关键的一步，只有体内的HBV-DNA定量指标降低，病毒的复制繁殖才会停止，乙肝的彻底治愈才有希望。

一般以定量检测103copies/ml以下为阴性，以上为阳性。

阳性提示体内病毒复制活跃，血液中含量高，传染性较强；阴性则相反，病毒复制已得到抑制，血液中含量底，传染性弱。

目前我国正在使用抗乙肝病毒药物包括干扰素类和核苷（酸）类似物，这两大类药物各有其优缺点。

前者的优点是疗程相对固定，乙肝病毒e抗原和e抗体血清学转换率较高，疗效相对持久，耐药变异较少，其缺点是需要注射给药，不良反应较明显，不适于肝功能失代偿者。

后者的优点是口服给药，抑制病毒作用强，不良反应少而轻微，可用于肝功能失代偿者，其缺点是疗程相对不固定，乙肝病毒e抗原和e抗体血清学转换率低，疗效不够持久，长期应用可产生耐药变异，停药后可出现病情恶化。

2、病毒分型和耐药检测各个编码区段存在着大量有意义的自然变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异株，从而导致 HBV感染的不同血清学和临床表现。

检测HBV的变异株对了解疾病机制、药物耐受和指导用药有一定的价值。

根据HBV基因组核苷酸序列的差异，乙肝病毒可以分为8个基因型，分别命名为A~H。

我国的乙肝患者基因分型主要为A、B、C、D四个型别，其中B和C基因型为优势基因型,分别占30%和60%。

D型基因主要分布在新疆地区。

不同的基因分型有着不同的临床意义，一般来说，A型基因预后较好，治疗应答率较高；B型治疗效果和预后要比C型好，C型治疗应答率最低，疗效不好，病情容易重症化，预后不良。

以普通干扰素ɑ治疗为例，如果是B型基因的乙肝患者，治疗有效应答率为41%（即乙肝病毒DNA 和e抗原转阴）；而对于C型基因的乙肝患者，有效应答率只有15%。

如果使用最新的长效干扰素（聚乙二醇化干扰素）治疗不同基因型的乙肝患者，也有不同的治疗有效应答率。

治疗A型基因的乙肝患者，乙肝病毒e 抗原血清转换率为47%，B型基因为44%，C型基因为28%，D型基因仅为25%。

也就是说，如果我们用干扰素治疗乙肝患者前，先对患者的乙肝病毒基因分型进行一次检查，就可以预测到远期治疗效果。

这是非常重要的措施，比如说一个乙肝患者经过化验检查，提示为C型基因，如果我们为其使用普通干扰素ɑ进行治疗，有效应答率只有15%；即便使用最新的长效干扰素治疗，有效应答率也只有28%。

像这种情况，最好选择其他治疗药物和治疗方案，不要硬着头皮蛮干。

(二）HPV基因检测在预防宫颈癌中的作用宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有50万左右新发病例。

我国每年有新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的26%。

HPV广泛存在于自然界,人的皮肤,消化道,呼吸道等都携带有这种病毒.持续的人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素，93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPV DNA。

大样本调查显示：HPV6 ,11 ,40 ,42 ,43 ,44 ,54 ,61 ,70 ,72 ,81 ,cp6 108等12种归为低危型，主要引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CINI), 多呈一过性，可自然逆转；高危型主要为HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82等15种，主要导致CINII-III级病变和宫颈癌的发生, 持续高危型HPV感染的CINⅠ级易进展为CINⅡ～Ⅲ。

高危型HPV-16和HPV-18分别占宫颈癌的50%和14%。

高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险增加250倍。

HPV DNA的检测方法实时定量PCR (Real time PCR)核酸杂交捕获（Hybrid CaptureⅡ，HCⅡ）HC Ⅱ可一次检测所有致癌的13种高危型HPV。

敏感度：对CIN Ⅱ、Ⅲ和癌的检出率为 98%。

阴性预期值：对高度鳞状上皮细胞病变或更高度病变的阴性预期值99.9%细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。

细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。

二、遗传性疾病的分子诊断遗传性疾病中常见的分子异常遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物——蛋白质（或酶）的表现异常所致。

基因突变主要包括点突变、片段性突变和动态性突变。

点突变 (point mutation)包括错义突变、无义突变、移码突变各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变蛋白质合成量下降无蛋白质合成片段性突变(fragememtal mutation)核苷酸的丢失和增多缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因组合排列在一起动态性突变(dynamic mutation)以三核苷酸为单位的重复序列在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。

脆性X综合征：CGG重复少年脊髓型共济失调：GAA重复亨廷顿病：CAG重复X染色体（xq27.3）的脆性位点脆性X综合征是遗传性智力缺陷最常见的一种。

致病基因FMR-1的5’端有CGG三核苷酸重复区。

普通男性群体中的患病率为1/4000。

普通女性群体中的患病率为1/6000。

患者智力低下、语言障碍、行为异常、呈特殊面容。

正常个体：CGG重复次数6~52次，中国人群以(CGG)28为多见。

前突变(premutation)： (CGG) 53~230为携带者，虽表型正常，但在传递过程中易发生进一步扩展，使后代的CGG重复次数大大增加，并有异常表型。

全突变： (CGG) ≥230时，100%的男性表现为典型的脆性X综合征,53%的女性表现为程度不同的智力低下。

(一）遗传性疾病基因诊断的策略1、直接诊断策略基因诊断的直接策略是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。

直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。

DMD的基因检测Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一种高发病率、高致残、高致死的X 连锁的遗传性疾病，在3500个活产男婴中即有一个患者。

DMD基因的全长为250kb，有79个外显子。

DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%～70%。

DMD基因外显子的检测2、间接诊断策略间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因。

间接诊断不是寻找 DNA 的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。

间接诊断：分析DNA的遗传标记的多态性双等位基因(bi-allele）多态性：限制性片段长度多态性（RFLP）第一代DNA遗传标记，所含信息量有限。

检测技术：Southern印迹技术、PCR直接分析法镰状细胞贫血(HbS)：第6位密码子A→TMstⅡ: CCTNAGGA: CCTGAGGAGS: CCTGTGGAGRFLP连锁分析Neurofibroma, NF1RFLP连锁分析多等位基因多态性(multi-allele)小卫星序列又称串联重复可变数目（variable number tandem repeats，VNTR）第二代DNA遗传标记以 6～70bp 为单位，以串联形式排列，构成数量可变的串联重复序列等位基因常常达10个以上，信息量比 RFLP大检测技术：PCR微卫星序列 (microsatellite)以 2～6bp 为单位，重复次数可达几十次，又称短串联重复序列(STR) 。

在基因组中分布广泛，出现的数目和频率不同，具高度多态性。