操作步骤
细菌接种与培养
取-70℃冰冻大肠杆菌DH5α菌种，用划线 法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养 过夜。第二天，从平板上挑取单个菌落，接种 至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养 过夜。次日取菌液30 μL接种至含有3 ml LB培 养基的试管中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时 （200~300r/min）。
注意事项
防止污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，
所用器皿，如离心管，移液枪头等需要经高 压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，并注意 防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否 则会影响转化的效率或是转入杂DNA。
化学法则更加简备：
RuCl法 CaCl2法
其原理是细胞在低温，低渗CaCl2（0.1M）作 用下，会发生膨胀，Ca2+使细胞膜磷脂双分子层 形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部 分核酸酶解离开来，诱导细胞成为感受态细胞。 转化时混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷 酸复合物粘附于细胞表面，通过热刺激，液晶态 细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入细胞。
注意事项
细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直
接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用 已多次转接，或贮存在4℃的培养菌液。应用 对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定 培养液OD600控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时， 细胞密度在5×107 个/ml左右，过高或不足均 会使转化率下降。
大肠杆菌感受态细胞的制备
实验目的
1. 熟悉感受态细胞制备原理。 2. 掌握大肠杆菌感受态细胞制备的方法。
实验原理
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用 转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中,一 般缺乏此种转移所必需的基因，因此不能自行完成从 一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体 转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感 受态以摄取外源DNA。经一定的理化方法诱导后，处 于适于摄取和容纳外源DNA的细胞，称为感受态细胞。
目前，制备感受态细胞已成为基因操作的常 规技术。感受态细胞:原核细胞或真核细胞。
特点： 细胞的通透性在制备过程中增强使其易于接
受外源基因。 细胞本身应为修饰、限制酶缺陷的菌株，使
外源DNA分子不易被切除或破坏。
制备感受态细胞可以使用电击法或化学法。
电击法是利用瞬时高压电流处理细胞悬浮液， 使细胞膜发生去极化，产生微孔，悬液中的 核酸就可通过微孔进入细胞。电击转化需要 仪器帮助
菌体收集
当菌落600nm OD值达到0.3~0.4时，将试 管取出放置冰上10~15分钟。在无菌条件下， 取1ml菌液装入1.5ml离心管中。4℃,5000rpm 离心5min。弃上清，将管倒置于干滤纸上 1min，吸干残留的培养液。
制备感受态
(振1)荡加混20匀0 μ，L 使冰菌预体冷悬的浮0.1，M冰Ca浴Cl320到m离in心。管中， (2) 4℃,5000rpm离心5分钟，弃上清，将管倒 置于干滤纸上，吸干残留液体。 (体3)，加放50至μ4L℃冰保预存冷备的用0.1，M2的4~C4a8C小l2，时重内悬使浮用菌效 果较好。如果暂时不用，可加入等体积的 30%的甘油（甘油终浓度为15%），混匀。液 氮速冻后保存于-80℃低温冰箱中待用，可保 存半年以上。