一 1.饱和链烷技术测定放牧家畜采食量及采食组成的原理和方法？链烷（alkane）是一种饱和的直连碳氢化合物，植物蜡质中所含的链烷一般含有21~35个碳原子，其中奇数链的碳原子占大多数，而且不同牧草品种链烷的含量和模式不同。

由于链烷在草食动物的消化道中不被消化，因此，根据采食牧草及排泄的粪中链烷含量和模式来评价草食动物对牧草的消化率及食性组成，以及结合外源定量投喂的偶数烷，用内外双指示剂的方法来评价草食动物的采食量。

*采食量计算：应用链烷估测采食量的原理就是根据链烷浓度在消化过程中变化，求出排粪量（F）和牧草的消化率（D），之后根据公式DMI=F/（1-D）求出干物质的采食量（DMI）。

*采食组成估测：通过放牧动物粪中链烷组成和所提供植物品种的链烷组成对比进行。

由于链烷的回收率不同，链烷的浓度必须用回收率的差异加以矫正，为了防止与实际日粮的偏差，常用几种碳链长的链烷。

Dove和Moore （1995）建立了一个“EatWhat”软件，可以利用牧草和放牧动物粪中链烷浓度寻找动物最适宜的食性组成。

二 1.简述双标记法测定食糜流量方法？原理：假定消化道某一部位食糜的流入与流出符合一室模型。

其中存在两个不同的相，两种标记物在两相中的分配系数不同；物质流入与流出是均衡的；并且无法取得代表性样本。

则标记物的浓度与注入时间的关系为：C(t)=C0(1-e-kt)，C0=f/Mk双标记测定法可以通过重组校正而获得代表性食糜样本。

2.试述常用液相和固相标记物及其制备？近年来最常用的液相标记物为Co-EDTA；颗粒标记物为Cr-CWC铬标记纤维（Cr-CWC)通过特定的媒染过程，使铬与植物细胞壁间形成很强的复合物，当媒染物中的铬含量超过8%时，这种复合物在瘤胃液和酸性介质中有良好的稳定性，并且基本上不被消化，这种复合物是目前所应用的颗粒相标记物中最独特的一种。

Cr标记纤维制备：称取一定量的重铬酸钠，溶于温水中，倒入待测饲料内，使铬的含量达到待测饲料干物质的12%-14%。

不断搅拌至稠粥状，此时饲料呈棕黄色。

然后将该饲料转移到带盖的搪瓷盘内，盖上盖，置于100℃烘箱中加热24 h，取出放入底部有一细筛网(孔径236μm)的桶内，用自来水冲洗过剩的氧化铬至滤出水澄清为止。

再将饲料悬浮于清水中，此时的pH值通常为8.5-9.5；加入抗坏血酸，使pH值下降到4.0，搅拌后静止12h。

若pH值最后不超过4.5，则需继续冲洗，使与饲料结合不紧的氧化铬完全被冲洗掉。

最后放在100℃烘箱内烘24h，即制备成铬标记的饲料。

Co-EDTA易溶于水，现已广泛用于瘤胃液相体积和稀释率的测定，分析方法简单，并且准确，在瘤胃中少量的Co-EDTA可能与颗粒食糜相结合，一部分复合物(<5%)被吸收，并从尿液中排出，在大多数情况下，与测定结果相比，其误差是微不足道的。

Co-EDTA制备：称25g乙酸钴、29.2gEDTA、4.0gNaOH，将上述药品放入烧杯中，加200ml的蒸馏水，加热至80℃进行溶解，冷却后加20ml 30%的H2O2溶液，室温下放置4h后加300ml 95%(V/V)的乙醇溶液，放在冰箱中12h，然后经定性滤纸过滤，用80%(V/V)的乙醇溶液洗涤沉淀数遍。

过滤后将与沉淀混合O。

在一起的乙醇挥发掉，在100℃烘箱中烘干备用。

所得沉淀既Na.Co-EDTA.3H2实测Co的含量为11%。

3.理想的消化道食糜标记物(指示剂)的应具备哪些条件？理想的指示剂应该具有以下四个特征：（1）完全不能被动物吸收（回收率100%）；（2）对消化道正常生理功能和微生物区系没有影响；（3）与所要标记的食糜内物质物理特性相近或能够与其紧密结合（CV<5%）；（4）对食糜样本内该标记物的分析方法特异性强、非常敏感，不能被其他物质干扰。

4.比较采用桥型瘘管和T型瘘管收集食糜的优缺点？消化道食糜流量的测定有两种方法：第一种是使用桥式瘘管，将每日通过某一消化道部位的食糜全部采集出来，称量和取样后，再通过该瘘管的远端入口全部送回动物消化道内；第二种是通过T形瘘管和指示剂完成，通过多天投放指示剂，使其在消化道中浓度稳定后，采集食糜代表性样本，分析其中指示剂含量，结合每天投入的指示剂量，就可以计算出每天食糜流量。

桥式瘘管优点是可以采集流出的全部食糜，样本的代表性强；费时费工，对试验动物的食糜流通过程干扰大、试验动物应激严重，存活的时间较短，不能用于持续时间较长的试验；T形瘘管对试验动物应激小，试验动物使用年限长，而且每天只要定时(一般间隔2～6个小时采集一个样本)采样即可，简便易行，但这种方法的准确性取决于消化道食糜指示剂的可靠性和采集样品的代表性。

三1.简述估测瘤胃微生物蛋白质产量的方法？（一）不含蛋白的纯化日粮法（二）应用微生物固有成分为标记物技术（三）外源同位素标记法（四）间接定量法：尿中嘌呤衍生物(PD)排出量估测（五）间接估测：应用瘤胃可利用能或降解氮估测。

2.嘌呤法测定瘤胃微生物蛋白质产量的基本原理和假设？嘌呤不仅存在于RNA，也存在于DNA，所以嘌呤与氮的比要比RNA/N的比更加恒定。

RNA酶和冷冻处理对RNA分析的影响并不会影响到嘌呤含量。

嘌呤的分析方法简单易行，较RNA法有较高的准确性。

分析食糜和食糜微生物部分的非氨态氮(NAN)含量和35S放射性活性。

并计算出微生物氮占食糜NAN 的比例，再结合不同消化道食糜流通量就可计算出MCP合成量。

小肠中的消化率，则可计算流入小肠的微生物嘌呤和微生物氮。

3.35S法测定瘤胃微生物蛋白质产量的基本原理和假设？原理：:将35S标记的硫酸钠溶液连续以相同速度灌注到瘤胃内，数日后，当35S 掺入瘤胃微生物蛋白的作用达到稳定状态时，按一定时间间隔采取瘤胃、真胃或十二指肠食糜样本。

分析食糜和食糜微生物部分的非氨态氮(NAN)含量和35S放射性活性。

并计算出微生物氮占食糜NAN的比例，再结合不同消化道食糜流通量就可计算出MCP合成量。

假设：（1）灌注入瘤胃中的35S始终与其微生物部分紧密结合在一起，或者说掺入瘤胃微生物蛋白的硫均来源于35S标记的瘤胃无机硫库；（2）含硫氨基酸直接掺入瘤胃微生物的数量可以忽略不计；（3）瘤胃微生物部分内含硫氨基酸与其蛋白质的比例比较恒定。

4.应用尿液嘌呤衍生物估测瘤胃微生物蛋白质产量的基本原理和假设？基本原理与假设：（1）日粮中的核酸和嘌呤在瘤胃中大部分可被降解，流入小肠的核酸大部分来自瘤胃微生物。

（2）瘤胃微生物核酸在小肠中被广泛降解，释放出核苷和碱基。

（3）被小肠吸收进入血液而没有被利用的嘌呤被转化为嘌呤衍生物，进而从尿中排出。

包括尿酸、尿囊素、黄嘌呤和次黄嘌呤四部分。

（4）如果已知嘌呤氮和微生物氮之比以及微生物嘌呤在小肠中的消化率，则可计算流入小肠的微生物嘌呤和微生物氮。

５．测定瘤胃微生物蛋白质合成量时，DAPA法、RNA法和尿中嘌呤衍生物法各有哪些优缺点？（1）DAPA法原理：DAPA存在于瘤胃细菌细胞壁上，含量相对稳定。

基本假设：饲料和瘤胃上皮细胞中的DAPA被广泛降解。

存在的问题瘤胃原虫中不含有DAPA，同时，DAPA在瘤胃中会被代谢。

造成测定结果代表性较差。

需要装有瘤胃瘘管和十二指肠瘘管的反刍动物。

（2）RNA法原理：瘤胃微生物含有RNA，且含量比较稳定。

基本假设：饲料和内源上皮细胞上的RNA被广泛降解。

优缺点：与DAPA法相比，RNA法的代表性较强。

但是，饲料的RNA未必完全降解。

需要装有瘤胃瘘管和十二指肠瘘管的反刍动物。

６．瘤胃食糜中微生物的分离方法？应用微生物固有成分作标记物估测MCP的前提是通过差速离心法提取微生物样本。

差速离心法的主要步骤是经2-8层纱布过滤去除大颗粒饲料残渣UDF、滤液150-1000×g离心、除去小颗粒UDF和原虫，滤液再经15000-32000×g低温离心，沉淀用生理盐水反复洗涤再低温离心，做为微生物样本。

采用此方法缺点是：1 样本一般认为主要是瘤胃细菌；2 离心力和离心时间不一致，导致不同研究结果缺乏可比性；3 微生物样本不能完全代表瘤胃细菌或全部微生物区系。

因为低速离心去除了部分个体比较大的瘤胃原虫，另外，被去除的饲料颗粒和部分原虫表面附着和包裹着大量的瘤胃细菌。

六氟化硫（SF6）示踪法测定反刍动物甲烷排放技术及其优缺点？测定优点：①这种方法不用限制动物，可以任其自由活动或采食。

②采样方便，不用直接从瘤胃中采样。

缺点：①SF6本身是温室气体，其增温效应是CO2的23900倍，在大气中存留时间可长达3200年。

②残留在乳和肉中的SF6又会引起其它问题。

③需要训练动物戴上缰绳和集气罐。

④SF6示踪技术不能测定整个消化道甲烷产生量。

在肠道内产生的甲烷，通过血液吸收，排出体外也可测定，但是直肠内产生不被吸收的甲烷，SF6法就无法测定。

⑤在放牧条件下，试验区的风速不能太大，否则影响测定结果。

ØSF6示踪技术是一种比较先进的动物甲烷测定方法、以操作简单、费用低、对动物应激小和取样测试方便等优点，最大优点是使在自然生产条件下成批测定动物甲烷排放量成为可能。

该技术克服了呼吸代谢箱测定法的缺点。

①在动物自然生活状态下直接测定其甲烷排放量，通过与呼吸代谢箱测定法的测定结果进行比较，数据准确；②试验方法简单，实际操作方便，且对动物刺激小，动物的适应期只需一天：③整个试验投资和运行费用低：④可同时测定大批动物，而且适宜在各种生产中使用。

因此，SF6示踪法以其优越性成为了目前比较先进的反刍动物甲烷测定方法。

１．进行反刍动物灌注营养时，灌注缓冲液为什么要用两条管子？用两条管子灌注缓冲液的目的是防止动物发生酸中毒。

如果只用1条管子灌注,若夜问无人观察时,管子断开,而挥发性脂肪酸（VFA）继续灌注,则会导致动物很快死亡而用两条管子灌注,即使有条管子断开,而另一条正常,则动物可以存活下来。

2、灌注结束后，是否需要向瘤胃内接种瘤胃液？灌注结束后，将动物移入圈内，开始饲喂少量优质干草，以后逐渐增加。

瘤胃内可自动建立起微生物区系。

为了加快建立微生物区系，可以从正常饲养的反刍动物瘤胃中抽取瘤胃液，接种于停止灌注营养的反刍动物瘤胃中。

3、应用灌注营养技术，可以进行那些研究工作？（１）瘤胃上皮对VFA等的吸收规律。

应用灌注营养技术可以研究瘤胃上皮对VFA、水分和矿物质离子吸收量。

已知灌入瘤胃的有关成分的数量，借助液体标记物技术测定从瘤胃中流入后部消化道的有关成分的数量，即可计算出通过瘤胃上皮的吸收量。

（２）反刍动物能量与蛋白质代谢之间的关系由于进行全消化道灌注营养的反刍动物没有瘤胃发酵过程，灌入消化道的VFA 和酪蛋白的数量可以精确定量，而且可以根据实验研究的需要，调整VFA（能量）和酪蛋白的比例，因此可以非常方便地研究能量和蛋白质代谢之间的关系。