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蛋白质糖基化
• 蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译 后修饰方式 ；
• 糖基化影响蛋白折叠、定位、转运、生物活性、 可溶性、抗原性、半衰期。
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• 1、N-linked glycosylation • a sugar attach to the amino group of an asparagine （天冬氨 酰）. • sequence motif AsnXaa-Ser/Thr
Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine（N-二 羟乙基甘氨酸 ）, pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 ) Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35 Buffer C: 0.15 M NaCl, 10 mM Bicine, pH 8.35
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
AOX2 利用甲醇的能力低 生长慢
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histidinol dehydrogenase gene (his4)
宿主His4突变，不能合成组氨酸， 在His缺陷培养基上不能生长； 质粒上有His4, 可合成组氨酸， 用His缺陷平板筛选转化菌株。
KM
AOX
质粒线性化后转化宿主细胞
线性化位点
线性化质粒发生同源 重组的几率提高
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pAO815和pPIC9K 在Sal I 、Stu I 单切, 在his 4插入（单交换）， 不破坏宿主的AOX1，转 化GS115后产生： His +/Mut+ 单交换
同源重组基因转移法 ：是将外源基因定位导人受体细胞染色体 上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一 或双交换，新基因片段可替换原有基因片段。
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Байду номын сангаас
2. CONSTRUCTION OF THE VECTOR
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胞内表达载体, pAO815
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胞外表达载体,
pIC9K
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pPIC9k, 胞外表达载体
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3. 多拷贝产生，pIC9K, 体内形成多拷贝
因为未线性化的环状质粒之间发生同源 重组的几率非常低
未线性化的环状质粒发生同源 重组的几率非常低
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2、O-linked glycosylation, In O-glycosylation, a sugar is attached to the hydroxyl group of a serine or threonine residue.
• no sequence motif defined
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保持感受态细胞在冰冻状态作转化！
• Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice. • It is critical to add DNA to frozen cell samples.
注:pAO815 和pIC9K是穿梭载 体, 可在大肠杆菌中 操作
转化宿主细胞
组氨酸缺陷平板 筛选重组子
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G418 筛选pIC9K 多拷贝
pAO815和pPIC9K
PCR检测 转化细胞中的基因插入
诱导表达 SDS-PAGE检测
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酵母菌转化
PEG 1000 Transformation Method for Pichia
酵母表达系统
优点
1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化
2 操作容易
3 经济 4 快速
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酵母细胞结构
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两种酵母表达系统
酿酒酵母表达系统 Saccharomyces cerevisiae 过去常用
毕赤酵母 Pichia pastoris 现在多用
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Pichia pastoris 表达系统
• Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯
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BMGY： Buffered Glycerol-complex Medium
BMMY： Buffered Methanol-complex Medium (1 liter) 成分：1% yeast extract 2% peptone 100 mM potassium phosphate, pH 6.0 1.34% YNB 4 x 10-5% biotin 1% glycerol （ BMGY ）or 0.5% methanol （ BMMY）
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• 3、C-Mannosylation （甘露糖化） • sugar is linked to the protein through a carboncarbon bond.
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• 4、 GPI anchor attachments. Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins. 糖基磷脂酰肌醇锚 • binding to the plasma membrane
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毕赤酵母系统的注意事项 1. 2. 3. 4. 5. 严格无菌操作，防止污染；可以镜检 温度≤30C; 转化 PCR检测 诱导时间
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酵母蛋白糖基化
• 酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露 糖型； • 然而毕赤酵母中蛋白翻译后所增加的寡糖链长度 （平均每个支链8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中 的（50-150 个甘露糖残基）短得多，但比人的大； • 酿酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖连接头，而毕赤 酵母则没有。一般认为α-1,3聚糖接头与蛋白的超抗 原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。
Filter sterilize and store at -20°C.
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制备感受态细胞
1. 划线接种酵母菌，YPD平板， 30°C for two days. 2. 挑菌落于 10 ml YPD 30°C 摇过夜. 3. 转培养到 100 ml YPD，starting OD600 of 0.1 and grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，室 温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭菌 的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀，液 氮快速冷冻， -70°C保存。
• To perform multiple transformations, it is recommended to process them in groups of six at a time.
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Transformation
• 1. 10-50 μg DNA（20 μl液体中）， 直接加到 still-frozen tube of competent cells（40 μg of denatured and sonicated salmon sperm DNA）； 2. 37°C 水浴5分钟， 中间混匀两次； 3. 加 1.5 ml of Buffer B ， 彻底混匀； 4. 30°C水浴1 hour； 5. 2000 x g 离心10 ， RT， 去上清，细胞悬浮在 1.5 ml Buffer C 中； 6. 离心后将细胞悬浮在 0.2 ml Buffer C中； 7. 将细胞涂布在选择培养平板（MD）上， 30°C for 3 to 4 days.
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pAO815
可体外构建多拷贝
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BamH I：GGATCC CCTAGG
Bgl II：AGATCT TCTAGA
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4. 宿主细胞 Pichia Strain 基因型
GS115
AOX1正常，Mul+
KM71
AOX1被破坏， MulS
宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突变 可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长 在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长
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毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：
1.蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。 2. 操作时与E. coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒 或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、 简单、廉价，且表达水平更高。 3.同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗 传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十 倍以至百倍。 这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
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pAO815和pPIC9K 在 Bgl II Bgl II双切：
在5AOX1位点和 3AOX1双交换，替 换掉了宿主的AOX1 基因， 转化后GS115产生 His +/Muts
5 AOX1
His4
3AOX1
gene
AOX1
His4
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技术路线
选择合适的内切酶位点 将基因插入载体
pAO815 体外构建多拷贝 线性化质粒
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YPD培养基
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 liter)
1% yeast extract 2% peptone 900 ml of water Autoclave for 20 minutes on liquid cycle. 2% dextrose (glucose)， （20%储存液，抽滤灭菌）。
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