三种筛选方法的比较
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (1❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组测序
宏基因组DNA提取 Illumina 高通量测序
组学系统分析
高通量基因克隆
利用测序结果，经序列比对分析， PCR直接扩增、克隆相关功能基因
通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利 用Illumilla的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进建 抽提DNA 克隆(多种载体) 转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌)
Uchiyama et al.,Nature,2009
SIGEX筛选流程
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019
SIGEX的优点和缺点
优点
➢能够筛选到新的代谢相关基因 ➢诱导底物不需要经过特殊修饰 ➢避免了引入酶切位点的麻烦和切断目的基因的可能 ➢ 结合流式细胞术，适于高通量克隆和筛选
Chakravorty 等（2019）总结16S rDNA 的序列，及其中 九个9个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的 可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60 bp）和V6 区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。
16S rDNA
➢通过设计特异的PCR引物，扩增得到V3或V6区的序列，然 后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对V3或 V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物 种丰度、种群结构、系统进tagenomic Library
通过PCR 或者杂 交筛选特定序列
SIGEX
通过功能筛选特 定表型的阳性克
隆
基于宏基因组分离筛选功能基因 的四个技术要素
载体 Vector
环境样品DNA制备 DNA Preparation
自然产品筛选平台
Natural Product Discovery Platform
➢ 异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来, 然后采 用较温和的方法抽提DNA, 如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞, 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解, 脉冲场凝胶电泳回收 DNA。 可获得大片段DNA (20～500 kb) 且纯度高, 但操作繁琐, 成本高, 有 些微生物在分离过程中可能丢失, 温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。
载体
➢ 一般选比较复杂的化合物，因其基因簇较大 ，则无法完整克隆。
➢ 细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入片断 ，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。因而可选要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。
✓16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对 应的DNA序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为 1500 bp
✓通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细 菌的分类和进化分析。
细菌16S rRNA的V3或V6区的测序分析
Ashelford 等（2019）通过对4383个细菌16S rDNA的序列 进行比对分析，表明16S rDNA 全长序列中包含9个可变区 （V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲 缘关系，可变区则表明物种间的差异。
screening），即底物诱导基因筛选，其基本原理 为：代谢相关基因通常由相应的化合物（如底物或 者代谢）与载体中的特定标签（如GFP）共表达的克隆子， 就能够筛选到相应的代谢基因。利用特殊载体，建立宏基因组，通过流式细BP和BL反应
Matsuyama and Yoshida，2009
Gateway 技术优点
不需要传统的酶切、连接方法 利用位点特异性重组，省时省力,可以实现高通量克隆 利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆,
典型的效率是>95% 在目的基因（或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®
ITS 1 和ITS 2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一 致,种间差异比较明显。IT S 的序列分析能实质性地反映出属间、 种 间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS 序列片段较小、 易于分析, 目 前已被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属 内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。
Metagenome VS Genome
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❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (1❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA
入 门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体， 创建各种各种各样的表达克隆
The Gateway® system 克隆ORFeome
利用The Gateway® system 的高通量、快捷、方便等特点，可以克 隆得到生物体的ORFeome，即全部编码蛋白质的ORF组成
Brandner et al., BMC Genomics,2019
此方法的优点是可能筛选获得某一类结构或功能的蛋白 质中的新分子，且能利用基因芯片技术大大提高筛选效率， 缺点是必须对相关基因序列有一定的预先了解，较难发现全 新的活性物质及其功能编码基因。
功能驱动筛选
生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行 功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子， 结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。
ORFeome的用途
得到生物体的ORFeome后，通过高通量诱导ORF 表达，利用“功能驱动筛选”，筛选得到相应的功能基因
高通量检测、筛选
功能基因、新型酶
缺点
➢不能筛选组成型表达的基因 ➢仅针对能进入细胞质的底物 ➢仅适用于插入片段带有自身启动子的情况 ➢出发菌株须与宿主菌株近缘 ➢T载体容量有限，>10kb的基因或操纵子难以克隆 ➢与GFP反向插入的目的基因将漏检 ➢目的基因与GFP之间有转录终止子的情况将漏检
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019
宏基因组功能基因的筛选
WCX 2019年3月17日
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❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组（Metagenome）
• Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于2019年提出，定义为 “the Genomes of the Total Microbiota Found in Nature”， 即指任何特定环境样品中全部微生物 遗传物质的总和, 并且目前主要是指环境样品中细 菌和真菌基因组的总和。
真菌ITS的高通量测序分析
➢ITS(Internal Transcribed Spacers )，即核糖体内转录间隔 区 ，是位于 28S rDNA的3’端与 18S rDNA的 5’端之间的序列 ➢ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bp ➢ITS包含ITS1和ITS2两个区域。其中ITS1 位于 18S rDNA和 5.8S rDNA之间，ITS2位于 5.8S rDNA和 28S rDNA之间
高通量筛选 High Throughput
Screening
宿主Host
环境样品DNA制备
➢ 原位裂解法：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理, 继而抽提纯 化。 此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小, 但由于强烈的 机械剪切作用, 所提取的DNA片段较小(1-50 kb)，且腐殖酸类物质也 难以完全fosmid为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌，但大肠 杆菌并不是一个很理想的高效表达外源基因的重要。
序列驱动筛选
基于DNA序列水平的筛选。根据某些已知的相关功能基 因的保守序列或相似序列设计杂交探针或PCR引物，通过杂交 或PCR扩增筛选阳性克隆子。
Metagenomic library
sequence
Screen for specific sequences by PCR or hybridisation
SIGEX
Functional screening for expression of particular phenotype
细菌16S rRNA的测序分析
Environmental sample
Extract metagenomic DNA
Construct 16S (18S) rRNA gene library using PCR
Clone into vector
eg plasmid, cosmid
phosmid, BAC
Introduce into host eg E. coli
高通量克隆ORF ——The Gateway® system
Gateway技术原理
Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染 色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合 与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个 反应构成的。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克 隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门 克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载 体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转 移目的序列到一个或更多个目的载体。
如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀 粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功 能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大 ，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。