宏基因组测序是什么？
[13]Fields, S. (2001). Proteomics in Genomeland. Science, 291(5507), 1221–1224.
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宏基因组学发展简史[1]
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临床宏基因组学发展现状[1]
2019年前108篇临床mNGS研究现状： A. mNGS在疾病诊断中的应用：
宏基因组测序
宏基因组测序简介 宏基因组学发展 如何完成一次mNGS
难点与挑战
概要
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“内因+外需”双轮驱动NGS需求
内因：感染性 疾病的新发和 再发对临床诊 断的准确性和 实效性提出更 高要求。
外需：“限抗 令”推动NGS在 该行业发展。
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为什么进行宏基因组测序？
很多病原体培养困难。
用电镜观察病原体，其灵 敏性相对较低。
病人1（肾移植）：取脑组织、脑脊 液、血清、肾脏、肝脏样本测序；
病人2（肝移植）：取脑脊液和血清 样本测序（454）。
通过测序鉴定了一个新的沙粒病毒， 该病毒会通过实体器官移植传播。
14岁联合免疫缺陷症男孩； 休假回来后，脑膜炎发作； 6周内做了38项检测，均为阴性； 5种高档抗生素用药，均为康复； 脑脊液mNGS，48小时出结果（MiSeq）； 检测到475/10196620条reads，钩端螺旋体； 上青霉素，32天后康复出院。
核酸提取方法
没有充分破壁可能会使一些细菌的检测变得困难（DNA没有充分释放）。样本量小会降不包括片段化的病原体基因组；仅靠DNA测序不能检测到RNA病毒。
测序方法
深度不足难以检测低丰度物种。同一测序过程中的样本之间可能会发生污染。与单端barcode相比，双端barcode可降低污 染。
病原核酸富集： Dnase I，2-~650倍[24]； RNA探针+Rnase H，2~724倍[25]； 抗体或CRISPER捕获，验室背景。
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测序数据分析——生信的重要性
数据库！ 20
测序数据分析——数据量要求
样本类型 建议测序数据量
2016年，FDA发布NGS用于感染疾病监测指南：微 生物鉴定、抗菌药物耐药性、独立标志物[20]
2018年4月，高通量测序技术写入中国成人医院获得性 肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南[21]
201检测流程
样本采集
样本处理
NGS测序
数据分析
报告解读
质控！ 《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》 《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》
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样本采集与运输
选择直接的感染部位标本，尽量抗生素使用前，病症明显时进行无菌采集。
• 脑脊液/BAL：选择第2管进行NGS检测； • 痰液：生理盐水漱口2-3次以上，咳取深部痰液；气管插管或切开时，吸取深部痰； • 组织样本：采样后直接放入无菌管冻存； • 血标本：尽量在患者寒战开始时，发热高峰前30-60min取样。
应用场景有限：成本高，目前mNGS主要集中应用于重大疾病、突发公共卫生事件和特定病例人群，目前尚未纳 入常规临床检测。
普及程度较低：认知和接受程度不足，检测结果的科学判读证据与逻辑尚待证实。 耐药和突变的鉴定：病原序列在总测序序列中含量极低，难以进行基因水平的鉴定。 流程标准化：缺少统一标准。 检测准确性：报告中含多种病原信息，夹杂背景病原，需更准确的病原鉴定算法和更快的鉴定速度。 结果数据复杂。 污染：宿主核酸、污染物核酸。 耗时：测序流程耗时过长。
数据量/M
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报告解读[23]
原则：
• 剔除试剂、环境中引入的假阳性病原体信息； • 剔除比对流程中交叉引入的假阳性病原体信息； • 报告病原体信息原则上准确到种，），同时也应包
含相应的属信息； • 建议将临床高度关注和健康者样本中极少出现的病
原体信息优先呈现； • 时将某些部位（如呼吸道、皮肤、肠道等）的常见、
低温运输
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样本处理
样本类型
血浆
脑脊液 肺泡灌洗液 全血 痰液
胸腹水 组织
人源背景细胞中位数 ~2.3×105 ~3×104 ~1×105
~7×106 ~1.5×107 ~5×107 ~107~108
样本要求量
1ml以上 5ml以上
5ml/3ml 1ml以上 1ml以上 100mg以上
检出限
• 细菌检出限：10~1000copies/ml； • 真菌检出限：10~1000copies/ml； • 病毒检出限：1000copies/ml； • 支原体/衣原体检出限：100~1000copies/ml； • 寄生虫检出限：10~100copies/ml
处理对照
阴性对照可以识别一些受污染的物种。内部阳性对照可减少实验变异性带来的偏差，提高对低水平物种的识别。
分析方法
小型精选数据库或高度严格的标准可能不包括新的或意想不到的物种，从而导致假阴性结果。未经整理的数据库或宽松的 标准也可能不正确的识别物种。
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临床宏基因组应用的局限和挑战[23,31]
质谱(MALDITOF MS)[2,4]
mNGS[7-9]
优势
• 通量大； • 检测急性或以前的感染； • 低成本
• 快速； • 高灵敏度； • 准确。
• 中通量
• 金标准 • 低成本
• 高通量； • 高特异性； • 低人工成本； • 省时。
• 高通量； • 不依赖培养； • 无偏倚检测； • 可发现新病原体； • 抗生素/抗病毒预测； • 功能预测分析。
几秒到几 分钟（培 养后）
极个别顶尖三甲
1~2天 （Nanopor e可将时间 缩短至几 小时）
几乎未开展
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定义：
宏基因组测序（MetaGenomics Next Generation Sequencing，mNGS），最早由威斯康辛大学植物 病理学部门的Jo Handelsman等于1998年提出，后被 伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter等 定义为“应用现代基因组学的技术直接研究自然状 态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分 离单一的菌株”[12]。
武汉金银潭医院收集了3份支气管肺泡灌洗液样本。 Illumina和纳米孔测序对基因组进行克隆和测序。 20,000个病毒测序片段。 与beta冠状病毒属B分支的基因组相匹配。 与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45，G772933.1）
的全基因组一致性超过85％。
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mNGS走向临床——共识与指南[20-23]
优势：
1、无偏倚，如一个标本中既有曲霉菌又有白色念 球菌，培养时，如果白色念球菌生长较快，便会影 响曲霉菌的生长，所以培养是有偏倚的，但理论上， 宏基因组测序对病原学诊断是没有偏倚的。 2、广覆盖，可以同时检测多种病原（如细菌、真 菌、病毒、寄生虫、支原体/衣原体、分枝杆菌等）。 3、无需先证知识，mNGS可以无需提前知道该样本 中的感染病原。
3/100万； 1000/100万（与宿 主高相似度）
细菌
1/100万 （胞内感 染菌）
真菌 5/100万
寄生虫 10/100万
报告中需注意取样和样本处理过程中引入的污染。
罕见病原
结合临床 进一步确 认
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宏基因组测序所需的设备
仪器设备 生物安全柜 移液器 超纯水仪（18.2兆欧） 紫外灯 冰箱 离心机和涡旋仪 天平/电子秤 金属浴/水浴锅 磁力架 超声打断仪 Qubit核酸定量仪 qPCR仪（定量） 凝胶电泳及成像系统 真空浓缩仪（如不需探针法富集病原核酸，则不需配置） PCR仪 测序仪（如果进行mNGS，建议配置NextSeq通量的测序仪，其他病原应用，可 配置MiSeq通量级别的测序仪。） 不间断电源（UPS） 片段分析仪（agilent、Qseq、PE labchip三个品牌选其一） 服务器（分析量较大时需单独配置机房，配置大型服务器）
试剂准备区 √ √ √ √ √ √ √
标本准备区 √ √
√√ √ √ √
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测序区 √ √ √
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正视mNGS在感染性疾病诊断中的偏好性[30]
样本收集方法
没有冷链或核酸稳定剂的样本收集可能会导致核酸降解和假阴性结果或一些生物体的过度生长，导致对丰度的误解。多次 冻融也会导致核酸降解。
75% 12
2019年12月26日——坊间发现
mNGS发现几十条SARS冠状病毒序列，且仅有 这一个有意义的病原体；
进一步分析，与Bat SARS like coronavirus有87% 相似，与SARS有81%相似。
补测数据，得到几乎完整基因组。
新冠病毒的发现
2019年12月30日——官方发现[19]
劣势
• 低灵敏性和特异性； • 对于细菌，相近的抗原易发生交叉反应。
• 检测特定感染； • 成本高于培养的方法； • 受扩增偏差影响； • 无法区分活细胞/死细胞。
• 结果稳定性、平行性差
• 准确率、可靠性依赖于技术经验； • 耗时耗力； • 敏感性会受到抗感染药物影响； • 难培养的病原不能鉴定。
用分布。
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最早的宏基因组应用——环境宏基因组[14-15]
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2008年——死后查因[16]
临床宏基因组应用先锋
2014年——首例临床，免死诊断[17]
2019年——病前预测[18]
3个病人在同一天接受同一个捐献者 的器官移植。在移植后4~6周均出现 发热后去世。
培养、PCR、血清学筛查、芯片检测 均为发现有用信息。
• 中枢神经系统； • 呼吸系统； • 消化系统； • 骨骼肌系统； • 视觉系统； • 血液循环系统； • 肝胆系统； • 泌尿系统； • 皮肤； • 其他。
B. 临床宏基因组研究的增长情况： C. mNGS研究在不同国家的分布情况； D. mNGS使用的技术平台分布； E. mNGS在不同感染疾病诊断中的应