宏基因组学研究方法及应用概述彭昌文 (山东省济宁学院生物学系 273155) 颜 梅 (山东省曲阜师范大学生命科学学院 273165)摘 要 本文简要介绍了宏基因组的概念,概述了其原理及应用。
关键词 宏基因组 宏基因组学 环境基因组学 基因文库的构建 迄今,人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1%的微生物的单个种群的孤立研究结果。
然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的,对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。
这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。
为了获得完整的环境微生物基因表达产物,早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路,1998年,AR I A D phar maceutical公司的科学家Handels man等首次提出宏基因组的概念[1]。
宏基因组(the genomes of the total m icrobi ota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和[2]。
它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。
而宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。
它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,为充分认识和开发利用非培养微生物,并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源,提供了可能,已成为国际生命科学技术研究的热点和前沿。
1 宏基因组学的研究方法宏基因组学的研究过程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作,可分为三个步骤。
1.1 宏基因组的提取 在宏基因组筛选过程中,目的基因是整个核苷酸链中的一部分,因此样品前期的富集能够提高筛选命中率。
DNA的提取是宏基因文库构建的关键步骤。
提取步骤通常需要满足两个条件:既要尽可能提取样品所有微生物的基因,又要保持片段的完整和纯度。
目前所开发的DNA提取方法有两种:细胞提取法和直接裂解法。
直接裂解法包括物理法(冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法)、化学法(常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等)及酶裂解法。
另外,依据提取样品总DNA前是否分离细胞,可以分为原位裂解法和异位裂解法。
原位裂解法可以直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA 得以释放,由于无需对样品微生物进行复苏,且黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性。
此法操作容易、成本低,DNA 提取率高,但由于机械剪切作用较强,所提取的DNA 片段小(1～50kb),通常适用于构建小片段插入文库(以质粒和λ噬菌体为载体)的DNA提取。
异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后采用较温和的方法抽提DNA。
此法条件温和,可获得大片段DNA(20～500kb),纯度高,但操作繁琐、成本高、得率低,通常适用于构建大片段插入文库(以柯斯质粒或者细菌人工染色体为载体)的DNA提取。
1.2 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建需适宜的克隆载体。
通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒、黏粒和细菌人工染色体等。
质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段,适用于单基因的克隆与表达。
黏粒的插入片段可达40kb左右,细菌人工染色体插入片段可达350kb,可用来制备由多基因簇调控的微生物活性物质的完整代谢途径的相关片段文库。
1.3 目的基因的筛选 目的基因的筛选方法包括序列分析和功能分析两种。
序列分析适用于小片段DNA文库的基因筛选;而功能分析通常适用于大片段DNA文库的筛选。
序列分析筛选不依赖于重组基因在外源宿主中的表达,因为所使用的寡聚核苷酸引物是直接通过DNA序列中的保守区域设计的,反映了氨基酸序列的保守性,可获得未知序列的目的基因。
该方法对DNA量的要求不高,筛选到新活性物质的可能性较大。
序列分析的另一个手段是对宏基因组克隆测序,无论是全部或随机测序都是发现新基因的有效手段。
对于功能分析而言,首先需获得目的克隆,然后通过序列和生化分析对其进行表征。
此法能快速鉴定出全新且有开发价值的活性物质,可用于医药、工农业等行业。
由于此法检出率较低,工作量较大,且受检测手段的限制,所以常要借助于高通量筛选。
2 宏基因组学的应用2.1 在生态学方面的应用 当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微生物与其所在环境中的代谢过程相联系。
应用16s r DNA作为系统发育锚去鉴定属于某种微生物的克隆,然后对基因进行测序,从而获得美国AP生物学课程简介及对我国高中生物学教学的启示杜程鹏 (复旦大学附属中学 上海 200433) 李幽兰 (华东师范大学生命科学学院 上海 200062)摘 要 本文介绍了美国AP生物学课程的知识框架、实验安排及考核方式,并结合生命科学教学实践,提出了对我国高中生命科学教学的建议。
关键词 AP生物学课程 AP生物学考试 探究性实验1 美国AP课程概览AP课程是Advanced Placement Pr ogram的(简称),在我国被译成“先修课程”。
它是美国大学理事会于20世纪50年代联合部分美国大学和中学建立的一套下放到中学的大学课程与考试项目。
优秀的中学生可以在高中期间选修大学1、2年级的课程。
在满足高中学生对某些知识领域特殊兴趣的同时,AP课程也给了他们提前进入大学就读的机会。
目前AP课程已经进入了世界80多个国家,除了美国的3000多所大学之外,还有40多个国家的600所大学认可并使用AP 成绩作为入学参考标准[1]。
学生入读这些大学后,可将考试通过的AP学分折抵大学学分,减免大学课程,以缩短学时、节省学费、获得奖学金和提前毕业等。
美国教育部的研究报告指出,在高中期间选修了AP课程的学生,大学的毕业率远高于其他学生。
数据显示,上过2门以上AP的美国学生,61%可以在4年以内获得学士学位,上过1门的为45%,而没有上过AP的学生只有29%能够在4年内获得学士学位[2]。
因此,是否在高中阶段修过AP,被绝大多数美国大学所看重。
AP课程共设22个选修科目、37门课程。
主要科目有:A rt(艺术)、Government and Politics(政府和政治)、H istory(历史)、B iology(生物学)、Calculus(微积分)、Human Geography(人文地理)、Italian Language and Culture(意大利语和文化)、Chem istry(化学)、Japanese Language and Culture(日语和文化)、Chinese Language and Culture(中国语言和文化)、Latin(拉丁语)、Com2 puter Science(计算机科学)、Music Theory(音乐理论)、微生物的生理学信息。
在研究的早期,科学家利用宏基因组研究探索海洋中未培养的以浮游生物为食的原核微生物,发现古菌螺旋状RNA和谷氨酸半醛转氨酶,并首次揭示了基因组织形态,这些信息都显示了非培养系统的生物潜能。
随着微生物治理的深入发展,研究者越来越趋向于应用菌群对废水进行生物治理。
宏基因组在生态方面的研究方法主要有宏基因组快照测序法、随机鸟枪测序法和荧光原位杂交法等。
宏基因组在生态学上的应用主要是土壤与水体。
目前宏基因组学在土壤微生物研究中的应用主要包括两方面:一是进行土壤微生物及其资源的挖掘,目前的研究工作已经得到大批新基因,特别是在一些极端环境中的微生物宏基因组的研究中得到了一些具有特殊应用价值的功能酶基因;另一方面是揭示土壤微生物的多样性及其与环境之间的关系[3]。
海洋蕴涵着非常丰富的微生物资源,目前已应用宏基因组技术研究了多种海洋次生代谢产物合成途径,其中最为经典的是研究海洋聚酮类和非核糖体肽类的生物合成基因簇[4]。
2.2 在新型生物催化剂中的应用 新型催化剂主要是酶。
传统的新型酶的筛选方法限制了筛选的广泛性和有效性。
宏基因组学则克服了这一限制,有效地提高了新酶的筛选效率,现已发现了抗生素及维生素生物合成相关基因簇的克隆,以及水解酶类和氧化还原酶类编码的基因。
宏基因组技术通过对环境的直接克隆,为研究和利用占微生物99%以上的非培养微生物提供了新的途径,为微生物的研究和发展提供了全新的策略。
但此技术的开发利用还有许多亟待解决的问题:如上面提及的两种DNA的提取方法各有其缺陷,使获得的DNA不能完全代表样品DNA组成,这就需要进一步优化样品DNA的提取方法。
另外,应根据筛选目的选用合适的载体和宿主菌。
再者,文库的筛选方法有待进一步完善,对于序列筛选法来说主要是测序的速度和费用问题,功能筛选法则需克服从几万到几十万个克隆中只能筛选到几个有活性的基因的状况,应建立更为敏感的高通量筛选方法。
主要参考文献[1]艾芳芳,杨木华,曲媛媛.2007.宏基因组研究及其应用研究进展.环境科学与技术,30(12):100～102[2]冯美琴.2008.宏基因组学的研究进展.安徽农业科学,36(2):415～416[3]钮旭光,韩 梅,韩晓日.2007.宏基因组学:土壤微生物研究的新策略.微生物学通报,(34):576～578[4]李丽娟,张殿昌,龚世园.2007.宏基因组技术在开发未培养微生物资源中的应用.水利渔业,27(3):7～9 。