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克隆基因的表达

第五章克隆基因的表达基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。

典型的基因表达是基因经过转录、翻译,产生有生物活性的蛋白质的过程。

基因的表达主要涉及到两个过程:转录和翻译。

思考:基因表达与克隆基因表达的异同? 从表达的对象、过程、场所等方面考虑。

第一节影响外源基因表达的因素利用基因工程技术高水平表达各种外源蛋白质,无论在理论研究还是实际应用上都是十分重要的。

因此,如何使外源基因在宿主细胞中高效表达,成为基因工程中的关键问题。

应该指出,现在基因工程所涉及的受体细胞多种多样,从细菌到高等动植物细胞,乃至动、植物个体;而所涉及到的基因也是成千上万,各不相同,这种差别使得对特定基因的表达研究就有其特定的个性。

影响外源基因高效表达的各种因素:1. 外源基因的表达效率①启动子的强弱。

有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一,也可以说,转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤。

因此,选择强的可调控启动子及相关的调控序列,是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。

最理想的可调控启动子应该是:在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏,这样可以避免出现表达载体不稳定,细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡等问题。

当细胞数目达到一定的密度,通过多种诱导(如温度、药物等)使阻遏物失活,RNA聚合酶快速起始转录。

②核糖体结合位点的有效性。

SD 序列是指原核细胞mRNA 5`端非翻译区同16S rRNA 3` 端的互补序列。

按统计学的原则,一般SD 序列至少含AGGAGG 序列中的4 个碱基。

SD 序列的存在对原核细胞mRNA 翻译起始至关重要。

③SD 序列和起始密码子AUG 的间距。

AUG 是最首选的起始密码子,GUG、UUG、AUU 和AUA有时也用作起始密码子,但非最佳选择。

另外,SD 序列与起始密码子之间的距离以9±3 为适宜。

④密码子组成。

尽量避免使用罕用密码子如:AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu)等。

2. 表达质粒的拷贝数和稳定性多数情况下,目标基因的扩增程度同基因表达成正比,所以基因扩增为提高外源基因的表达水平提供了一个方便的方法。

对于原核和酵母表达体系而言,选择高拷贝数的质粒,以其为基础,组建表达载体。

表达载体的稳定性是维持基因表达的必需条件,而表达载体的稳定性不但同表达载体自身特性有关,也与受体细胞的特性密切相关。

所以在实际运用时,要充分考虑两方面的因素而确定好的表达系统。

利用选择压力、尽量减少表达载体的大小、通过建立可整合到染色体中去的载体等待方式,可以增加表达质粒的稳定性。

3.表达产物的稳定性①组建融合基因,产生融合蛋白。

融合蛋白的载体部分通过构象的改变,使外源蛋白不被选择性降解。

这种通过产生融合蛋白表达外源基因,特别是相对分子质量较小的多肽或蛋白编码的基因,尤为合适。

②产生可分泌的蛋白。

如将外源基因表达产物分泌到大肠杆菌细胞的周质或直接分泌到培养基。

③外源蛋白可以在宿主细胞中以包涵体形式表达,这种不溶性的沉淀复合物可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解,也便于纯化。

④选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞,有可能减弱表达产物的降解。

⑤采用位点特异性突变的方法,改变真核蛋白二硫键的位置,从而增加蛋白质的稳定性。

4. 工程菌的培养条件由于细菌在100L以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下200mL摇瓶中的生长代谢活动存在很大差异,在进行工业化生产时,工程菌株大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。

优化发酵过程既包括工艺方面的因素也包括生物学方面的因素。

工艺方面的因素如选择合适的发酵系统或生物反应器,目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。

生物学方面的因素包括多方面,首先是与细菌生长密切相关的条件或因素,如发酵系统中的溶氧、pH 值、温度和培养基的成分等,这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。

生物因素的第二方面是对外源基因表达条件的优化。

在发酵罐内工程菌生长到一定的阶段后,开始诱导外源基因的表达,诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。

使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代谢,而且能提高表达产物的产率。

生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。

外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。

在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下,提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。

5.细胞的代谢负荷外源基因在细菌中高效表达,必然影响宿主的生长和代谢,而细胞代谢的损伤,又必然影响外源基因的表达。

合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系,是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节。

第二节外源基因在原核细胞中的表达系统外源基因在原核细胞中表达是基因工程操作中最初取得成功的途径。

1 原核生物基因表达的特点同所有的生命过程一样,外源基因在原核细胞中的表达包括两个主要过程:即DNA转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质。

与真核细胞相比,原核细胞的表达有以下特点:①原核生物只有一种RNA 聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动子,催化所有RNA 的合成。

②原核生物的表达是以操纵子为单位的。

操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合,是一个基因表达的协同单位。

调控区主要分为三个部分:操纵基因(operator)、启动子(promotor)及其他有调控功能的部位。

③由于原核生物无核膜,所以转录与翻译是偶联的,也是连续进行的。

原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA,转录成mRNA 后,可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。

在翻译过程中,mRNA可与一定数目的核糖体结合形成多核糖体(Polyribosome)。

两个核糖体之间有一定长度的间隔,为裸露的mRNA。

每个核糖体可独立完成一条肽链的合成,即这种多核糖体可以同时在一条mRNA 链上合成多条肽链,大大提高了翻译效率。

在双链DNA 分子中,只有一条链转录成mRNA,这条链称为有意义链(sense strand),该基因的另一条链则称反意义链(antisense strand)。

在含有许多基因的DNA 双链中,每个基因的有意义链并不是在同一条DNA 链上。

也就是说,一条链上既具有某些基因的有意义链,也含有另外一些基因的反意义链。

由于mRNA 聚合酶是沿着DNA 链的3’→5’方向移动,DNA 链与合成的RNA链有反平行关系,所以mRNA 链的合成方向是5’→3’,mRNA 上的信息的阅读是从多核苷酸链5'末端向3’末端进行。

从转录和翻译的方向也可看出,在原核生物细胞内当mRNA的合成还没有完成时,蛋白质或多肤的翻译就己经开始了。

④原核基因一般不含有内含子(intron),在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。

因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNA 前体后,其中内含子部分不能被切除。

⑤原核生物基因的控制主要在转录水平,这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。

对RNA 合成的控制有两种方式,一是起始控制(启动子控制),二是终止控制(衰减子控制)。

⑥在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上,含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3'末端碱基互补的序列,即SD 序列,而真核基因则缺乏此序列。

从上述特点可以看到,欲将外源基因在真核细胞中表达,必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和SD 序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件,也就是说必须满足以下条件:⑴通过表达载体将外源基因导入宿主菌,并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白;⑵外源基因不能带有间隔顺序(内含子),因而必须用cDNA 或全化学合成基因,而不能用基因组DNA(genomic DNA);⑶必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达;⑷外源基因与表达载体连接后,必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame);⑸利用宿主细胞的调控系统,调节外源基因的表达,防止外源基因的表达对宿主菌的毒害。

2 原核生物作为受体细胞具备的特点外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后,导入合适的受体细胞,并能在其中有效表达,产生目的基因产物(目的蛋白)。

由此可知,外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。

基因表达系统有原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统。

目前应用最广泛的是原核生物基因表达系统,如大肠杆菌表达系统、芽胞杆菌表达系统等。

原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点:①原核生物大多数为单细胞异养,生长快,代谢易于控制,可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。

②基因组结构简单,便于基因操作和分析。

③多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体,便于构建相应的表达载体。

④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。

⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统,表达产物无特定的空间构象。

⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白,造成表达产物的不稳定性。

近年来,真核生物基因表达系统发展很快,真核生物如酵母菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等也被广泛用作基因表达系统的受体细胞,并构建了一系列相应的表达载体。

要使外源基因在细胞中高效表达,构建的表达载体必须具备基因表达的基本条件,这些条件包括外源基因在细胞中的拷贝数、基因转录的水平、mRNA 翻译的速率等。

大肠杆菌是一种革兰氏阴性细胞,其遗传背景清楚,目标基因表达的水平高,培养周期短,目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的,它是目前为止应用最广泛的基因。

3 在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统,由于待表达的外源基因结构具有多样性,尤其是真核生物基因的结构与大肠杆菌基因结构之间存在较大的差异,因而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。

一般来说,高效表达外源基因必须考虑以下基本原则:①优化表达载体的设计。

为了提高外源基因的表达效率,在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定mRNA 翻译的SD序列进行优化。

具体方法包括组合强启动子和强终止子;增加SD 序列中与核糖体16S rRNA 互补配对的碱基因序列,使SD 序列中6~8 个碱基与核糖体16S rRNA 的碱基完全配对;根据待表达外源基因的不同情况调整SD 序列与起始密码子ATG 之间的距离及碱基的种类;防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构。

②提高稀有密码子tRNA 的表达作用。

多数密码子具有简并性,而不同基因使用密码子的频率不相同。

大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性,在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。

如编码Pro 的密码子包括CCG、CCC、CCU 和CCA 等,而其中的表达系统。

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