1、最小分子量测定法
测定蛋白质中某一微量元素的含量 如Mb含Fe为0.335%，则M=55.8/0.335%=16700。 这就是最小分子量。其实，真实分子量是最小分子 量的n倍，n指Fe的数目，Mb的n=1，所以 M=16700。
4、凝胶过滤法 （gel filtration)
分子筛效应： 大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来
第四部分 蛋白质纯度鉴定
蛋白质纯度鉴定
色谱纯：在层析图谱中只有一个洗脱峰 电泳纯：在电泳图谱中只有一条电泳条带 结晶纯：能够获得蛋白质晶体 溶解度曲线单转折


相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方 法可能表现为不均一，因此需要互相验证。
电泳纯
结晶纯 色谱纯
第五部分 蛋白质的分离纯化方法
增加蛋白制品 (preparation) 的纯度 (purity) 或 比活（specific activity）。 去除变性的和不要的蛋白质。 所得蛋白质的产量达到最高值。
蛋白质分离纯化的一般程序

前处理（pretreatment） 粗分级分离（rough fractionation） 细分级分离（fine fractionation） 结晶(crystallization)及蛋白质的鉴定

根据目标蛋白的特性，制定由粗到精，由 分离效率低到分离效率高的纯化路线 特殊：亲和层析 制定快速有效的目标蛋白跟踪方法 （酶活 性，抗原-抗体反应，其它方法） 纯度：
SDS-PAGE （染色方法） HPLC


计算纯化效率与产率
蛋白质纯化的一般注意事项
在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻 注意维护它的稳定，保护它的活性。
4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基 -2,2’-二喹啉（BCA）形成配合物，显紫 色，比色测定。
5．考马斯亮蓝法（Bradfold法）
考马斯亮兰法是1976年由Bradford建立的， 是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马 斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合 ，使染料最大吸收峰的位置由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕红色变为兰色。 经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性 氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相 结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋 白质浓度成正比。

1．双缩脲法 2、紫外吸收法 3．Folin-酚法（Lowry法） 4．BCA法 5．考马斯亮蓝法（Bradfold法）
1．双缩脲法
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝 色。当底物中含有肽键时（多肽），试液 中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通 过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的 波长为540nm。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ① SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结 合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。 这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度 负电荷，分子量大小与迁移率成正比。 ② SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟 形的长椭圆棒型。
四、蛋白分子的结构和形状
单位：Dalton(道尔顿）,
英国化学家、物理学家，原子学说创始人John Dalton. 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12=1/N g( N为阿伏伽德罗常数) ≈1.67×10-27千克
蛋白质分子量的测定
1、最小分子量测定法： 2、渗透压法 3、超离心法 4、凝胶过滤法 5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、前处理（pretreatment） 去杂质、脱脂 细胞破碎
机械破碎法
研磨法 组织捣碎器法 超声波法 压榨法 冻融法

溶胀 自溶 化学法 酶解法
缓冲液溶提、离心或过滤去除细胞碎片
缓冲液的选择

离子强度：0.1-0.2 M pH范围：7.0 - 8.0 磷酸盐缓冲液 Tris缓冲液 1、抗氧化剂：DTT，BME，Cys，GSH 2、酶抑制剂：EDTA，蛋白酶抑制 PMSF 3、酶的辅因子或辅基 4、植物细胞（酚类化合物）：PVP 5、抗菌剂：NaN3
5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质 的变性。 6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。 7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/L DTT(或β巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。 8、加1~10mmol/L EDTA金属螯合剂，防止重 金属对目标蛋白的破坏。 9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。
纯化实例：纯化Taq DNA聚合酶
带负电荷的蛋白质 脱水作用
－ － － － － －
碱
酸
－ －
带正电荷的蛋白质
不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
溶液中蛋白质的聚沉
二、蛋白质的胶体性质
胶体性质（colloidal system）
胶体溶液的特点： 分散相质点直径在1-100 nm内 分散相质点带同种静电荷，不易聚集沉淀 溶于水 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
Bradford法的优点
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突 出优点，因而得到广泛的应用。这一方法是目 前灵敏度最高的蛋白质测定法。 （1）灵敏度高 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。 （3）干扰物质少。
缺 点
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸 的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测 定时有较大的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰 物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸 钠（SDS）和0.1 N的NaOH。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，测定未知蛋白 的595nm吸光值需落在标准曲线的线性范围内。
蛋白质的分离纯化方法

分子大小：透析，超过滤，凝胶过滤层析等 溶解度：沉淀，盐析等 电荷：电泳，离子交换等 吸附性质：吸附层析 对配体分子的生物学亲和力：亲和层析
根据分子大小不同的纯化方法
1. 透析、超过滤
加 压
血液透析
血液
透析液
小分子溶出 小分子被带出
透析机
脱盐，浓缩
2.密度梯度离心
一、蛋白质的酸碱性质
两性电解质 可解离基团：α-NH3+ α-COO侧链上的功能基团 氨基酸有的化学性质蛋白质就有。 pI=正负电荷相等，净电荷为零时的pH.
水化膜 + + + + + + + － － － －－ － － －
酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用
碱 酸
带正电荷的蛋白质 脱水作用
+ + + + + + + +
最常使用的两种缓冲液

添加成分

2、粗分级分离
目的：去除杂蛋白，核酸，多糖等杂质， 同时浓缩蛋白质溶液

特点：简便，处理量大 方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分 级分离、超过滤、凝胶过滤、冷冻真空 干燥、加热变性沉淀，等等。

3、细分级分离
目的：进一步纯化目的蛋白
特点：规模较小，分辨率很高
2．紫外吸收法
由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和 色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收 峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因 此可作蛋白质定量测定。 280nm比色，测定后蛋白质溶液还能回收， 操作简便，但精确度不高。
3．Folin-酚法（Lowry法）
蛋 白质 中的酪 氨酸或 半胱氨 酸 ，能 与 Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色 化合物，500nm比色测定。 Folin-酚试剂的配制比较复杂。
蛋白质的分子结构包括
一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure)
球状和纤维蛋白质
根据蛋白质分子的形状可分为：
球状蛋白质(globular protein) 纤维状蛋白质(fibrous protein)

1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的水生栖热菌(Thermus aquaticus)
1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。 2、不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL-mg/mL。 3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的 缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。 4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的 降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解 DNA，防止DNA对蛋白的污染。
利用溶解度差别的纯化方法
1. 等电点沉淀和pH控制
蛋白质处于等电点时， 其静电荷为零，由于相邻蛋 白质分子之间没有静电斥力 而趋于聚集沉淀。
等电点沉淀实例
①工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性 蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定 浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现 含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0 的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40% 饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液 再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。
方法：一般使用层析法，还可以选
择电泳法
4、结晶及蛋白质的鉴定
只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形 成结晶。纯度越高，溶液越浓越容易结晶。 由于结晶中ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ未发现过变性蛋白质，因此蛋白质 的结晶不仅是一个纯度的标志，也是断定制品处于 天然状态的有力指标。
第三部分 蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定

1966年，Andrews得出一个经验公式： lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开 始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所 流出的体积。Vo为外水体积，Mr为相对 分子质量，a和b为常数。