1、最小分子量测定法
测定蛋白质中某一微量元素的含量 如Mb含Fe为0.335%，则M=55.8/0.335%=16700。
这就是最小分子量。其实，真实分子量是最小分子 量的n倍，n指Fe的数目，Mb的n=1，所以 M=16700。
ห้องสมุดไป่ตู้、凝胶过滤法 （gel filtration)
分子筛效应： 大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来
一、蛋白质的酸碱性质
两性电解质 可解离基团：α-NH3+
α-COO侧链上的功能基团 氨基酸有的化学性质蛋白质就有 pI=正负电荷相等，净电荷为零时的pH
水化膜
+++
酸
+
+碱
++
碱
－ －
－ －
酸
－ －－
－
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
脱水作用
++ +
+
+
+ ++
脱水作用 碱
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
① SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结 合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。 这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度 负电荷，分子量大小与迁移率成正比。
② SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟 形的长椭圆棒型。
四、蛋白分子的结构和形状
1、前处理（pretreatment）
去杂质、脱脂
细胞破碎
机械破碎法
研磨法 组织捣碎器法 超声波法 压榨法 冻融法
溶胀 自溶 化学法 酶解法
缓冲液溶提、离心或过滤去除细胞碎片
缓冲液的选择
离子强度：0.1-0.2 M pH范围：7.0 - 8.0
最常使用的两种缓冲液
磷酸盐缓冲液 Tris缓冲液
1966年，Andrews得出一个经验公式： lgMr = a/b—Ve/bVo
Ve 为洗脱体积。它是自加样品开始到该 组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的 体积。Vo为外水体积，Mr 为相对分子质 量，a和b为常数。
5、 SDS-PAGE 测分子量
(sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis)
添加成分
1、抗氧化剂：DTT，BME，Cys，GSH 2、酶抑制剂：EDTA，蛋白酶抑制 PMSF 3、酶的辅因子或辅基 4、植物细胞（酚类化合物）：PVP 5、抗菌剂：NaN3
2、粗分级分离
目的：去除杂蛋白，核酸，多糖等杂质， 同时浓缩蛋白质溶液
特点：简便，处理量大
方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分 级分离、超过滤、凝胶过滤、冷冻真空 干燥、加热变性沉淀，等等。
通常长轴与短轴之比小于10者为球状蛋白 质，大于10者为纤维状蛋白质。
球状蛋白质
近似于球形或椭圆形，生物界中的大多数蛋白 质为球状蛋白质，如大多数的酶类、血红蛋白 、肌红蛋白以及多种溶解于胞液或体液中的蛋 白质。球状蛋白质一般可溶于水，并且具有特 异的生物学活性（如血红蛋白运输氧、酶起催 化作用等）。
Advanced Biochemistry Fall 2015
Protein Separation and Purification
蛋白质分离和纯化-I
蛋白质分离纯化的必要性
需要单一的蛋白质研究其结构与功能
化学修饰需要单一的蛋白质
纯化改造过的蛋白质，从而开发出性 能更优良的蛋白质
Lecture Outline
蛋白质的分子结构包括
一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure)
球状和纤维蛋白质
根据蛋白质分子的形状可分为： 球状蛋白质(globular protein) 纤维状蛋白质(fibrous protein)
纤维蛋白质
纤维状蛋白质多是构成机体的结构 材料，如皮肤、肌腱、软骨及骨组 织中的胶原蛋白，肺、大动脉等中 的弹性蛋白,毛发及皮肤中的角蛋 白,蚕丝中的蚕丝蛋白等。它们一 般难溶于水，在机体中起着粘合、 支撑、保护、负重和营养等功能。 纤维状蛋白质的更新较慢。
第二部分 蛋白质的分离纯化原则和程序
蛋白质分离纯化的一般原则
蛋白质属于生物大分子之一，分子量范围可达1万 至100万之间，其分子的直径在1~100 nm，为胶粒 范围之内。
蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷（双电层） 水化膜：1g蛋白结合0.3-0.5g水
蛋白质溶液具有丁达尔效应、 布朗运动以及不能通过半透膜等 性质
三、蛋白质分子量的测定
蛋白质分子大小 6—1,000 kD
蛋白质的分离纯化的基础 蛋白质的分离纯化原则和程序 蛋白质的含量测定 蛋白质纯度鉴定 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质层析技术 蛋白层析的主要技术
10/12/2015
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第一部分
蛋白质的分离纯化的基础：
结构和特性
蛋白质的结构和特性
1. 酸碱性质 2. 胶体性质 3. 分子量的测定 4. 结构和形状
单位：Dalton(道尔顿）,
英国化学家、物理学家，原子学说创始人John Dalton. 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12=1/N g( N为阿伏伽德罗常数)
≈1.67×10-27千克
蛋白质分子量的测定
1、最小分子量测定法： 2、渗透压法 3、超离心法 4、凝胶过滤法 5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
增加蛋白制品 (preparation) 的纯度 (purity) 或比活（specific activity）。 去除变性的和不要的蛋白质。 所得蛋白质的产量达到最高值。
蛋白质分离纯化的一般程序
前处理（pretreatment） 粗分级分离（rough fractionation） 细分级分离（fine fractionation） 结晶(crystallization)及蛋白质的鉴定
脱水作用
－－
酸－
－
－
－－ －
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
溶液中蛋白质的聚沉
二、蛋白质的胶体性质
胶体性质（colloidal system）
胶体溶液的特点： 分散相质点直径在1-100 nm内 分散相质点带同种静电荷，不易聚集沉淀 溶于水 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
3、细分级分离