原理:羰基的邻位具有活泼亚甲基的化合物,在碱性的氢 氧化钾乙醇溶液中,与间二硝基苯反应呈红~蓝色.
Zimmermann反应,羰基的邻位具有活泼亚甲基的化合物,在碱性的 氢氧化钾乙醇溶液中,与间二硝基苯反应呈红~蓝色.雌酮是17-酮甾 类,因此根据该反应生成紫红色化合物,必须使用高纯度的间二硝基 苯,否则呈褐色而难于判定.
二 结构与性质
UV紫外分光光度法
主要活性基团
性
质
A环为3–OH 苯环
C17 –乙炔基 C17 –羟基
UV、与重氮苯磺 酸盐反应 与AgNO3反应 可成酯
1. 酚羟基
雌激素 重氮苯磺酸 类药物
红色偶 氮染料
C3为酚羟基的雌激素，能与重氮苯磺酸反应生成红 色偶氮染料。如JP(13)收载的苯甲酸雌二醇利用该法 进行鉴别。
戊酸雌二醇
补佳乐是戊酸雌二醇口服剂型，属 天然雌二醇。可拮抗克罗米芬抗雌 激素的副作用。 当体内的雌激素偏低时，多数会 使用它来迅速补充。而且效果也不 错。副作用也少。
炔 雌 醇
雌二醇、雌酚酮及雌三醇的生物活性强度比 是100∶10∶3。三种天然雌激素在体内可相 互转化：
O 脱氢酶 OH 羟化酶 OH OH
的具α–乙炔基；C13上有角甲基，
C10上无角甲基。 α–乙炔基如炔雌醇
OH
C D
C3-OH、C17-OH在体内易 与葡萄糖醛酸或 H2SO4结合成酯，可进行代谢
A
B
HO
2 化学性质 • ①弱酸性： C3-酚OH 遇Fe 络合显色 • ②氧化性：仲醇OH（C17-OH）易被氧 化，
不能口服，易在消化道破坏， 故制成透皮贴剂、栓剂或肌注。
采用分流进样方式
高效液相色谱法( HPLC)
示例 炔诺孕酮炔雌醚片--2000版药典标准
流动 相：乙腈－水（80:20） 检测波长：220nm
色谱条件 填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶
测定法
取本品20片，精密称定，研细，精细称取适量（约相当于炔诺孕酮 12mg），置50ml 量瓶中， 加流动相适量，超声处理使溶解，放冷， 用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液与内标 溶液 各 1ml，混合摇匀，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取炔诺孕酮 和炔雌醚对照品适量，用流动 相制 成每1ml中含炔诺孕酮0.12mg和炔 雌醚0.06mg的溶液，精密量取此溶液与内标溶液各1ml,混合摇匀， 取 20μl 注入液相色谱仪，测定。按内标法以峰面积计算，即得。
八 高效液相色谱法
保留时间一致鉴别
第三节 特殊杂质检查
一 杂质来源 硒 雌酮 ↑ ↑
原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂 等杂质
二
特点
（1）可能存 在多个甾体 杂质 （2）结构类 似
其他甾体 物都称为“其他甾体” 甾体激素药物多由甾体母体或结构类似的其 他甾体激素制备而来,也具有一定的药理作 用而又互相不相同,使其他甾体或有关物质 的限度检查显得非常必要,成为甾体激素药 物纯度检查的一个重要项目.目前国内外多 采用TLC和HPLC，36中原料中34中采用薄 层色谱法检查;10中原料已采用HPLC法.
甾体的一般结构
甾体化合物具有一个母核（A、B、 C、D组成），此母核含有一个由 环戊烷与氢化菲并联的碳骨架， 看上去像“田”字，环上的碳原 子按图示顺序编号。几乎所有的 这类化合物分子中，在C10、C13 处均分别连有一个甲基，称为角 甲基 在C17处有一侧链，这样在母核上 的三个侧链像“巛（chuān]字， “甾”字十分形象的表示了这类 化合物的基本碳架。
USP、BP、JP均采用RP－HPLC（大多内标法）
三、Kober反应比色法
1. 原理
雌激素
H2SO4-乙醇 △
Kober反应比色法Kober反应是指雌 激素与硫酸-乙醇共热呈色，用水或 稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变， 并在515nm附近有最大吸收。
黄色
H2O
△
桃红
λmax=465
Kober反应有两步：①与硫酸-乙醇光热产生 黄色，在465nm处有最大吸收；②加水或稀 硫酸稀释，重新加热显桃红色，在515nm处 有最大吸收。
λmax=515
雌二醇-3-甲醚
OH

H SO
CH3
CH3O
CH3O
λmax=465
CH3
HO H SO
CH3O
λmax=515
二、气 相色 谱 法(GC)
• 色谱分析条件：
主要仪器 ： HP6890气相色谱仪，FID检测器，固相萃取柱(500mg/ml) 主要试剂： 雌三醇，雌二醇，双酚A和4-壬基酚均用甲醇配成质量浓度 1g/l的标准储备液。临用时逐级稀释成工作所需的标准液。（甲 醇，二氯甲烷均为色谱纯） 色谱柱：HP-5毛细管柱（30m×0.32mm×0.25um) 柱温 ：300℃ 载气流速：1.0ml/min 汽化室和检测器温度：310 ℃
雌激素
雌激素
十八碳固醇类激素---甾醇类激素
卵泡激素 黄体激素
主要由卵巢产生，但人类的胎盘、肾上 腺皮质甚至睾丸也产生少量雌激素。 生理功能：促进女性器官发育、排卵。
1、 雌激素主要由卵泡和黄体产生。 促卵泡激素与黄体生成素统称促性 腺激素。具有促进卵泡发育成熟作 用，与黄体生成素一起促进雌激素 分泌。
2. 乙炔基的沉淀反应
含炔基 的雌激 素
R ห้องสมุดไป่ตู้ CH
硝酸银
银盐沉淀
炔雌醇
AgNO3
R C CAg↓
三 制备衍生物测定其熔点
生成酯,肟,缩氨基脲,或利用醇制碱液水解甾体酯类生成 相应的母体,然后测定其熔点.
四
水解产物的反应
酯的生成：如炔雌醇制成苯甲酸酯。
戊酸雌二醇先在碱液中水解，经酸化加 热分别产生戊酸特臭
• ③易成酯：C17-OH可成酯
其酯水溶性增大，很快由尿排出体外， 作用时间短。
第二节 鉴别试验
一 与强酸呈色反应
特点:操作简便,反应灵敏,通过形成的颜色或荧光的不 同而互相区别,但操作条件不易掌握.
目前它的反应机制尚不明确，可能机制为浓 硫酸与甾体酮基质子化反应,形成正碳离子, 然后与HSO4-作用呈色。
结构特征：酚羟基、C17 –OH
C17 –乙炔基
3300—3310 cm-1
ν CH
3300cm1
1615cm
-1
CC
1590cm1
3610cm-
ν OH
1
酚羟基
3505cm1
ν OH
1505cm苯环的骨 架振动
1
醇羟基
炔雌醚片 2000版药典
七 薄层色谱法
简便,快速,分离效能高等特点.
天然雌激素
OH CH3
OH CH3 H OH H
HO
HO
Estradiol
Estriol
雌二醇
O CH3
雌三醇
HO
卵巢主要合成雌二醇(E2)及雌酮(E1)二 种雌激素，但在血液循环内尚有雌三醇 (E3)。雌三醇是雌二醇和雌酮的降解代 谢产物，活性最弱。
Estrone
雌酮
目前常用雌激素药物
雌二醇贴片
二)高效液相色谱法 色谱条件如下:
1.色谱填充柱: C16硅胶反相色谱柱 2.流动相: 40 % 乙腈 + 60 %水混合液。 3.检测器:紫外(200nm).
研究表明，水中含有１ ｎｇ／Ｌ雌激素或１００ ｇ／ Ｌ的 环境激素就可引起水生生物生殖系统的改 变，一些研究证实， 天然雌激素对 水生生物的Ｖｔｇ的诱导活性不仅远大于其它环 境 激素，而且还是雄鱼产生Ｖｔｇ的主要的引发 剂．随着人 口数量的增加和养殖业的迅猛发展， 以及化工产品的迅速增加， 排放到环境中的天然雌 激素和环境激素将不断增加，这将会增 加对水环境 中生态平衡的威胁．所以我们要对水环境进行雌激 素的含量测定 RIA 及 ELISA 具有很高的灵敏度, 可检测到空气及受污染 的水源中微量的雌激素, 但均存在交叉响应的问题, 测定值常 高于真实值, 不宜作为含量测定方法，hplc具有样品用量少、 灵敏度较高、 分离效能好、 快速等优点 因此被USP、 JP、 BP 及中国药典等采用。
醋酸,戊酸和己酸酯水解后鉴别酸.
五 紫外分光光度法
C=C-C=O和C=C-C=C共轭系统,可用规定波长和吸收度比 值法鉴别
六
红外分光光度法
结构复杂,各国药典几乎均采用红外分光光度法鉴别,中国 药典95版.36种原料,其中33种采用该法.
OH
IR法
C CH
炔雌醇
HO
3500--3600左右 3200--3700
理论板数按炔诺孕酮峰计算应不低于3000，和组分峰与 内标物质峰的分离度应符合 要求。
其他甾 体 与标示药物结构不同的甾体化合
↓
1、 硒
来源
剧毒
合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢
2、 雌酮
Zimmermann反应
齐默尔曼
炔雌酮中雌酮检查方法如下: 取本品5mg溶于0.5ml乙醇,加间二硝基苯 0.05g,再加新配制的稀氢氧化钾-乙醇液 0.5ml,在暗处放置1h后,再加乙醇10ml时,溶 液呈现的颜色不得比下面的对照液更深. 对照液:不加本品同样方法制成.
OH
雌二醇就是卵泡激素，一般口服会引起很多 副作用（乳房疼痛、体重增加、高血压、胆 结石及肝功能异常等）所以是一种通过皮肤 吸收的雌激素治疗剂。通常为了使用方便， 常通过对其进行改造修饰，引入乙炔基，可 使其效力增加，并且可以口服
雌二醇：
CH3
HO
炔雌醇
Estradiol
化学名为雌甾-1，3，5 （10）-三烯-3,17β-二 醇。
HO 雌酚酮
HO 雌二醇
HO 雌三醇