微生物发酵法生产透明质酸
郭学平透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞、血管壁等，其中以人脐带、公鸡冠、关节滑液和眼玻璃体含量较高。

透明质酸价格昂贵，在日本有“白金”之称，目前的生产方法有发酵法和提取法两种。

1 透明质酸的发展
1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。

20世纪70年代，Balazs等从鸡冠和人脐带提取HA，并配制成眼科手术用黏弹性辅助剂—NIF-HA,开创了HA医学应用的先河。

由于HA优良的保湿和润滑性能，20世纪80年代初开始用于高档护肤化妆品，其需求量大幅度增加。

受原料限制，从人脐带和鸡冠提取的HA产量低、成本高，不能满足市场需求。

为了寻找HA的新来源，降低生产成本，研究了发酵法生产HA。

工业化发酵生产HA是日本资生堂最早开始研究的，他们借鉴前人对某些链球菌产生HA这一重要发现，利用现代发酵技术和设备，以提高HA产率为目的，对发酵生产HA进行了较全面地研究。

80年代中期，日本已有发酵生产的HA上市，价格大大低于从动物原料提取的产品。

提取法和发酵法生产HA的比较见表1。

表1 提取法和发酵法生产HA的比较
项目提取法发酵法
存在状态在原料中与蛋白质和其它多糖
形成复合体，分离精制复杂在发酵液中游离存在，分离精制容易
分子量与保湿性小于1.0×106,保湿性差大于1.5×106，保湿性强品质与产量取决于动物原料的品质与数量品质稳定，产量大
价格（化妆品用） 2.2万元/kg 1.6万元/kg
应用价格昂贵，化妆品中的添加量
受到制约
能增加化妆品中的添加量
发酵法生产HA方面的研究主要集中在日本、英国和美国也有少量报道。

国内从1980年开始研究从鸡冠和人脐带提取纯化HA，在1990年前后
化妆品用HA和医药用HA先后研制成功并生产。

山东省生物药物研究院（原
山东省商业科技研究所）是国内最早从事HA研究开发的单位之一，1990
年该院郭学平等在国内首先开始HA的发酵生产研究，先后完成了小试和中
试实验。

发酵法生产HA的研究成功改变了我国HA生产技术的落后局面，
使我国HA的生产进入了新的发展时期。

2 化学结构及理化性质
HA是由（1→3）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡糖醛
酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖，见图1。

图1
HA的结构非常规则，相同的双糖单位为HA的基本结构单元，不同动物组织和细菌来源的HA无种属差异，对人类及动物无抗原性。

HA分子链的长度及分子量是不均一的，分子量范围为2×105～70×105，双糖单位数为300～11000对，属于生物大分子。

商品HA一般为钠盐形式，为白纤维状或粉末状固体，有较强的吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂，药用级分子量为1.0×106～4.0×106，化妆品级为5×105～1.5×106。

HA水溶液最突出的特点是高黏度，这是由其结构所决定的。

HA具有很长的线性分子链，且分子链上等距离的葡糖醛酸上的羧基所带的负电荷相互排斥，使分子链呈伸展状态，而不卷缩成一团。

即使在较低浓度下，HA 分子间也有强烈的相互作用，因此具有很高的黏度，同时具有很好的润滑作用。

在水溶液中，HA分子链之间形成疏松的网状结构，能够结合并保持大量的水，即具有较强的保水作用。

HA在临床和化妆护肤方面的应用正是基于其高黏度、润滑性和保水性质。

阳离子可降低HA溶液的黏度，离子强度越高，黏度下降越多，二价阳离子降低HA溶液的黏度作用大于一价阳离子。

某些三价阳离子（如Fe3+）可使HA分子间发生交联，使溶液呈凝胶状，黏度大大增加。

多种物理和化学因素（如酸碱性、温度、透明质酸酶、紫外线、γ-射线等）可使HA大分
子降解，导致黏度下降。

在HA及其制剂的生产中，应尽量减少分子链的降解，保持其大分子特性。

3 HA的应用
3.1 医学方面
由HA制备的眼科制剂有手术用黏弹性辅助剂、滴眼剂、骨科制剂有关节腔注射液（用于补充关节滑液，治疗关节疼痛）等；另外，HA可促进创伤愈合，治疗烧伤；HA与化疗药结合，具有靶向引导作用，能引导药物进入肿瘤部位，杀灭癌细胞，减轻化疗副作用。

HA作为人体的基本物质，对其生理和药理作用的研究才开始，随着研究的深入，HA在医学方面的应用还会更加广泛。

3.2 化妆品
HA 是国际公认的理想的天然保湿因子（NMF），是目前高档护肤品、发用制品用量最大品种。

3.3 美容保健食品
在日本，HA从20世纪90年代开始用作具有美容作用的保健食品，服用后可增加人体内HA的合成，提高皮肤中HA的含量，使皮肤保水量增加，光滑细嫩而富有弹性。

4 HA的发酵生产方法
4.1 发酵法工艺过程
取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液的锥型瓶中，在37℃下培养12 h～16h, 接种于种子罐中。

培养液中氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏等，碳源为葡萄糖，于37℃搅拌培养12 h～16h，接种于发酵罐中，接种比例1：
10。

发酵液配方基本与种子液相同，只是葡萄糖含量较高，一般为3%～6%。

维持通气量0.3 vvm～1.0vvm（每分钟相对于单位发酵体积的通气量），搅拌转速120rpm，37℃发酵40 h～46h。

在发酵过程中，发酵液的pH值不断下降，需调pH= 6.5～7.0。

发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5％以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。

发酵结束，用三氯乙酸调pH=4.0～4.5,板框过滤除菌体，滤液调pH=6.0～6.5,加3倍体积的95％乙醇，沉淀出HA。

用与发酵体积相同的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解沉淀，在搅拌下，加入过量的1%CPC与滤液中的HA发生络合沉淀，静置，虹吸出母液，加入0.1mol/L氯化钠溶液洗涤沉淀两次。

于发酵体积的0.4mol/L氯化钠溶液中搅拌解离过夜，过滤，滤液加乙醇沉淀，乙醇脱水，真空干燥得HA。

4.2 工艺说明与讨论
链球菌的营养需求较高，通常要求培养基中含血清、小牛肉浸出液、脑心浸出液等，但这类营养物质价格昂贵，大规模生产中用其作为培养基，成本太高。

所以在选择菌种时，要考虑其营养需求及所用培养基的成本问题。

发酵生产HA所用的培养基，氮源为蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出粉、牛肉浸膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等；碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖；其他还有磷酸盐、硫酸盐，钾、钠、钙、镁等无机盐，以及铁、锰、铜、锌等微量元素。

链球菌属于兼性厌氧菌。

在HA的发酵工艺中，大多数采用有氧发酵。

也有的采用厌氧发酵。

根据HA生物合成路线，有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是合成HA的两个活化前提物（UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖）所必需的物质。

因此从代谢调
控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成。

通过增加通气量和提高搅拌转速可提高发酵液的溶氧，但转速过快可导致HA的机械降解。

在HA的发酵过程中,pH值是一个重要的因素，一般控制在6.0～8.5范围内。

链球菌是一种乳酸菌，产生乳酸等小分子有机酸的总量远大于HA，需用碱液进行中和，以维持适当的pH值。

发酵液中的HA在菌体外的溶液中游离存在，进行下游分离纯化时，首先杀灭和除去发酵液中的菌体，通常加入杀菌剂或加热到75℃～80℃进行灭菌，最常用的杀菌剂为三氯乙酸和阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）HA的含量较高时，发酵液的黏度很高，直接过滤或离心除菌体非常困难，需要先进行稀释。

除菌体后的清液，经乙醇沉淀、氯仿处理、CPC 沉淀、离子交换、超滤等方法进行分离纯化，最后用有机溶剂沉淀、真空干燥或冷冻干燥制得HA精品。

目前国内HA的发酵产率为4 g/L～6g/L，国际先进的HA发酵产率为6 g/L～7g/L。

发酵法是HA生产的发展方向，应从提高产率、提高产品分子量和分离纯化技术方面进一步深入研究。

[原文发表于：精细与专用化学品，2002，3（4）：21～22]。