燕山大学课程设计说明书微生物发酵法生产透明质酸的研究学院（系）：环境与化学工程学院年级专业：10生物化工学号：100110050050学生姓名：王伟伟指导教师：张晓宇教师职称：副教授燕山大学课程设计（论文）任务书院（系）：环境与化学工学院基层教学单位：生物工程系燕山大学课程设计成绩评定表2013 秋季学期生物工程专业课程设计结题论文微生物发酵法生产透明质酸的研究学院（系）：环境与化学工程年级专业：10 生物化工学号：100110050050学生姓名：王伟伟指导教师：张晓宇教师职称：副教授为提高微生物发酵生产透明质酸的质量，本设计选用经过突变后的高产兽疫链球菌株做为发酵用的菌种，并且在发酵前经过了严格的灭菌操作。

设计内容主要分为三部分：摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响；培养条件对发酵结果的影响；通过发酵过程中各种参数的变化优化发酵条件。

第一部分设计拟采用正交设计法确定最合适的种子培养基；第二部分设计拟单因素分析法确定外界最适发酵条件；第三部分通过测定发酵过程的各种参数绘制参数变化曲线，为发酵条件的优化提供科学依据。

通过本次设计，制定出兽疫链球菌生产透明质酸的合适工艺流程。

关键词：透明质酸；兽疫链球菌；正交设计；单因素分析第一部分文献综述1 透明质酸 (1)1.1 概述 (1)1.2 结构 (1)1.3 HA理化性质 (2)1.4 HA的合成和代谢 (3)1.4.1 HA的合成 (3)1.4.2 HA的代谢 (4)1.5 HA的生理功能 (5)1.5.1 构成多种基质 (5)1.5.2 保水、润滑、渗透压调节及分子排阻效应 (6)1.5.3 对细胞的作用 (6)1.5.4 与蛋白质的结合及其作用 (6)1.6 HA的应用 (7)1.6.1 HA在化妆品领域的应用 (7)1.6.2 HA在医学领域的应用 (8)1.6.3 HA在食品领域的应用 (8)2 HA的制备 (9)2.1 从动物组织中提取 (9)2.2 微生物发酵法 (10)3 国内外发展概况及其市场发展前景 (11)第二部分课程设计1.材料 (14)1.1 试验用的仪器 (14)1.2 试验药品 (14)2. 方法 (15)2.1 细菌发酵法生产透明质酸的工艺路线 (15)2.2 兽疫链球菌发酵生产透明质酸的工艺流程 (15)2.2.1 摇瓶种子液的培养 (15)2.2.2 种子罐种子液的培养 (16)2.2.3 发酵 (16)2.2.4 下游分离纯化 (16)2.3 检测方法 (16)2.3.1 HA 含量的检测方法（Bitter-Muir 咔唑法） (16)2.3.2 还原糖的测定方法—DNS法 (17)3．设计 (18)3.1 摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响 (18)3.2 培养条件对透明质酸发酵的影响 (20)3.2.1 摇床转速对摇瓶种子培养的影响 (20)3.2.2 温度对摇瓶种子培养的影响 (20)3.2.3 添加剂对摇瓶种子培养的影响 (21)4．分析与展望 (21)5．设计体会 (22)参考文献 (24)第一部分文献综述1 透明质酸1.1 概述透明质酸(HyaluronioAcid, 简称HA) 是一种由N-乙酰葡糖胺和D-葡萄糖醛酸双糖单元交替连接而成的酸性粘多糖。

1934 年Meyer 等自牛眼玻璃体内提取分离得到一种大分子多糖命名为HyafuronicAcid. 根据全国科学技术名词审定委员会公布的《生物化学名词》将其译为“透明质酸”，而《中国药典》国家药品标准则将其称为“玻璃酸”。

目前国内在多种领域中用透明质酸，而在与药品有关的领域则用玻璃酸。

经过半个多世纪的研究，人们对透明质酸的结构、理化性质和生理功能已有了明确的认识，在药品、化妆品、保健品以及临床眼科、骨科、皮肤科等领域有较多的研究和应用。

[1]例如，由于其具有良好的保湿功能，广泛用于化妆品及口服美容保健食品中；作为粘弹性保护剂用于眼科手术和关节腔内注射治疗类风湿性关节炎和骨性关节炎等关节疾病；作为媒介在滴眼液中广泛应用；交联的透明质酸在术后粘连的预防和软组织修复等应用中获得成功；透明质酸与其他药物反应形成的加合物对药物发挥控释作用，可达到定向和定时释放的目的。

近几年对透明质酸生理功能的认识有了重大突破，已形成了有透明质酸合成缺陷人的生命不可能存活的认识，可见其对肌体的重要性。

由于透明质酸具有如此独特的生理功能，决定了它在药品、化妆品等工业上具有广泛的应用价值。

因此对透明质酸的研究开发及其产业化的形成具有重要的意义和非常广阔的市场前景。

1.2 结构卡尔·迈耶实验室在1950年代阐明了透明质酸的化学结构。

透明质酸是一种高分子的聚合物。

是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖[2]。

D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1,4-配糖键相连。

双糖单位可达25000 之多。

在体内透明质酸的分子量从5千到2千万道尔。

分子式：（C14H20NNaO11）n结构式如图：1.3 HA理化性质HA 具有许多天然豁多糖共有的性质，外观为白色、无定型固体[3]，水溶液带负电，电泳时移向负极。

在高浓度1% 时，分子间会因氢键形成物理交联，呈网状形式存在，有很高的黏弹性和渗透压[4]。

其水溶液的比旋度为-70°~ -80°与阿利新蓝、亚甲基蓝反应呈蓝色。

在酸、碱、高温、X射线、γ射线、紫外线、超声波、铁、铜等金属离子、抗坏血酸或半胱氨酸等还原剂、氧自由基、透明质酸酶等因素下可发生降解，导致其黏性下降。

经注射进人皮肤和关节的HA 其半衰期一般不超过24 h[5]。

商品透明质酸钠(Sodium hyalurone, 简称SH) 为白色纤维状或粉末状固体，无臭无味，有强吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。

HA 溶液呈现非牛顿流体流变性，即HA 溶液的粘度随剪切速率的增加而显著的降低[6]。

HA 溶液的这种特性可以理解为分子间的摩擦在较高的切变速率下，HA 分子被拉长或变形，此时溶液粘度的大小不在完全取决与分子量的大小，同时也取决于HA 分子的大小即浓度，同一浓度的HA 水溶液，即使分子量不同，当切变速率达到某一特定值时，其粘度可降至相同。

而对同一相同分子量的HA 溶液，在任何切变速率下，粘度总是与浓度呈正比关系。

1.4 HA的合成和代谢1.4.1 HA的合成很早就知道HA 是由尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖（UDP-GlcNAc）和尿苷二磷酸-葡糖醛酸（UDP-GlAc）合成而来[7]，但对其合成场所及合成过程不甚明了。

直到20 世纪80 年代，对HA 的合成机理才有了明确的认识。

Prehm 的研究发现，细胞浆膜的膜内壁是合成HA 的场所，在HA 合成酶的作用下，HA多糖链的还原末端所连UDP 释出，多糖链交替连接上UDP-GlcNAc 和UDP-GlAc，生成的HA 链伸出细胞外，使其不受限制地延伸。

HA 的合成与其他大分子多糖如硫酸软骨素、肝素等不同，后者的合成场所为细胞内的高尔基体，糖链的延伸发生在非还原端，合成后还需要进行硫酸化、差向异构化和脱乙酰化等改构[8]。

对一些原核细胞和真核细胞的HA 合成酶进行了结构和功能研究。

目前已知成纤维细胞的HA 合成酶的组成和结构，也明确了不同亚基在HA合成中所起的作用。

VandeRijn 等[9,10]发现，链球菌细胞膜内有三种蛋白质发挥与UDP-GlAc 结合作用。

在真核细胞内，也发现了一系列具HA合成活性的蛋白质。

这些浆膜蛋白质在HA的合成过程中发挥合成及转动功能。

O’Regan等[11]对HA 的合成机理和有关基因的研究进行了详述。

许多因素可调控HA 的合成，通过调节HA 合成酶分子中大、小亚基的磷酸化程度以调节HA 合成酶活性。

当存在合成HA 的前体物质UDP-GlcNAc 或UDP-GlAc 时，合成酶大亚基内的酪氨酸则发生自动磷酸化，这是引发HA合成的必经步骤。

小亚基丝氨酸也可磷酸化，当丝氨酸磷酸化程度增高时，酶的活性即降低。

激素、炎症因子、生长因子、细胞流行性物质、腺苷酸环化酶、肿瘤细胞等均可通过调整HA 合成酶的活性来调节HA 的合成。

1.4.2 HA的代谢通过对合成HA 的前体物质进行标记、对HA 标记以及直接测定未标记HA 注入不同时间后在注入部位的残留量等手段，对HA 在体内的代谢进行了研究，包括对临床用药途径如注入眼前房内、关节腔内等的HA 的清除进行了考察。

20世纪80 年代后，Dahl 等设计了新的方法，将HA 连接上[125I]-酪胺纤维二糖标记物，后者在HA 代谢时随HA 从细胞外转移至细胞内，在溶酶体发生降解时，可残留在代谢部位的细胞内长达数小时，据此可测定不同部位HA 的代谢比率和清除率，弥补了以前的方法只能确定HA 的代谢部位而不能准确测定其代谢量的不足。

在正常状况下，HA 在体内主要是通过酶降解而清除，但发生某些疾病时，体内产生的自由基也可对其产生降解作用，如发生RA 时，滑液中的氧自由基导致其中的HA 发生降解。

降解HA的酶主要为透明质酸酶（HAas）、β-D-葡糖苷酸酶和β-N-乙酰-D-氨基已糖苷酶。

HA 的代谢和清除主要发生在局部、淋巴系统和等组织，HA 首先与细胞受体结合，被摄入到细胞内，与溶酶体融合后，先经Haas降解，形成HA 寡糖，再β-D-葡糖苷酸酶和β-N-乙酰-D-氨基已糖苷酶的进一步作用降解成单糖。

生成的单糖转移至胞质内，进一步氧化分解成小分子物质排出体外，或作为前体物质重新用于合成HA。

迄今为止，除脑组织以外，对HA 在各组织中的代谢情况已基本了解。

研究发现，HA 除在其合成处部分发生代谢以外，大量的HA 转移至淋巴结和肝脏代谢。

在皮肤、软骨、骨及细胞间质（ICM）等组织中，HA与组织内的其他成分结合密切，主要以结合状态存在，有些主要以新、老替代方式发生局部代谢。

以皮肤为例，每天代谢量为局部所含HA 总量的20% 左右。

体内呈游离状态的HA 如关节滑液、细胞间液、外周淋巴液、血液中的HA以及注入的外源性HA 则主要在淋巴结和肝脏代谢。

淋巴结可从传达室入淋巴液中截留其所含HA 总量的50%～90%, 在此发生部分降解。

HA 在血液中的代谢速率很高，如对人和兔的研究结果表明，静脉注射进入血液的HA在血液中的半衰期很短，只有2.4～5 min, 清除比率常数为0.13～0.28 min-1, 相当于每1 min有25% HA 从血浆中清除掉。

血浆中的HA 主要在肝脏发生代谢而清除，研究发现，静脉搏注标记的HA 后，占注射总量90% 的放射性物质被发现集中在肝脏。

HA 被淋巴结和肝脏摄取进而清除是由受体介导而生的，淋巴窦的内衬细胞和肝脏窦间隙内皮细胞是摄入HA的主要细胞。