(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910151712.6
(22)申请日 2019.02.28
(71)申请人 贵州省人民医院
地址 550002 贵州省贵阳市南明区中山东
路83号
(72)发明人 侯净 倪青 魏娜 贾琦 刘欣
胡诗航
(74)专利代理机构 北京栈桥知识产权代理事务
所(普通合伙) 11670
代理人 潘卫锋
(51)Int.Cl.
C12N 5/09(2010.01)
C12N 15/85(2006.01)
(54)发明名称
一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构
建方法
(57)摘要
本发明公开了一种HER2基因过表达的乳腺
癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：S1：对乳腺
癌细胞进行培养；S2：通过对乳腺癌细胞PCR扩
增，建立表达系统；S3：对乳腺癌细胞系进行构
建，S4：进行细胞观察和荧光强度对比。
本发明通
过实时荧光定量PCR检测HER2基因在mRNA中的表
达情况，以证明细胞系构建成功。
本发明构建的
乳腺癌细胞系可以稳定表达HER2基因，具有整合
效率高，假阳性率低等优点，为进一步研究HER2
基因乳腺癌发生、发展、治疗及后续耐药过程中
提供基本且有力的研究工具。
权利要求书2页 说明书7页CN 109694853 A 2019.04.30
C N 109694853
A
权 利 要 求 书1/2页CN 109694853 A
1.一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，在温度为30-35℃条件下培养1-2h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动频率为50-80r/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，进行转接培养3-5次，再在水浴温度为30℃、通气量为5-10m3/h的条件下震荡处理2-4h，得到乳腺癌细胞；
S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为60-75℃的条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至20-30℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁力棒搅拌处理，处理30-45min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶电泳，通过pBS-T Mini Kit中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒；
S3：所述质粒作为模板，pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A、pGenesil-ETV1B、pGenesil-ETV1C、pGenesil-NC重组siRNA表达载体；在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH2O2μl。
以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取150μl培养物涂布于LB/ Kan平板上37℃倒置培养10小时；
S4：对培养后培养物进行转染Marc-145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc-145细胞重选，调节细胞悬浮液密度，培养3-6h，然后将培养后的Marc-145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为60-70％时，向四孔中分别加入转染试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养3-5h，洗涤，观察细胞状态及荧光强度。
2.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为硝酸铵15-20g/L、黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L。
3.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L、硝酸铵15-20g。
4.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR反应体系及反应条件：通过无菌超纯水稀释至10μM/L；取已经稀释好的两条互补的mRNA靶点序列片段各1.5μl，10×T4buffer1μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，RT产物8.7uL，4×PCR缓冲液3uL，15mM的氯化钾3uL，PCR引物溶液1.5uL，DNA聚合酶0.5uL混匀后加入到87孔样品板上进行PCR反应，反应条件：85℃，8min；90℃，25min，60℃，30秒钟，65℃，2min，循环30次；70℃1min；4℃直至收取PCR产物。
5.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中所得的质粒通过阳性克隆筛选，进行阳性克隆筛选时，先平均取得质粒，均匀涂布到含去去甲基金霉素培养基平板上，培养6h，然后抽提质粒，将培养物在温度为20-30℃的条件下，滤膜过滤，通过EcoRI进行单酶切鉴定，被EcoRI切开的可能是阳性克隆。
6.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中从-70℃中取出质粒细胞，冰上放置4min，待质粒细胞解冻后，加入9μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置10min；然后将之放到预加温到30℃的水浴锅中，静置70s；快
2。