中国农业科学 1999,32(增刊):94～102Scientia A gricultrua Sinica植物与病原菌互作和抗病性的分子机制3刘胜毅1 许泽永1 何礼远2(1中国农业科学院油料作物研究所,武汉 430062;2中国农业科学院植物保护研究所)提要 概述了近几年在寄主植物抗病基因与防卫反应基因、病原菌毒性基因、寄主抗病性机制和抗病基因工程策略等方面取得的主要进展,重点分析了抗病反应的一般过程、毒性基因产物胞外水解酶和毒素的作用与关系、作物抗毒素基因工程策略。
关键词 植物;抗病基因;防卫基因;毒性基因;基因工程策略早在40年代末50年代初,F lo r(1947;1955)在对亚麻和亚麻锈菌互作的遗传规律研究中,提出了基因对基因假说(gene2fo r2gene hypo thesis)〔4,5〕,这标志着对植物与病原菌互作的认识深入到了基因水平,从而为应用分子生物学手段研究植物抗病性奠定了基础。
本文概要地综述近几年在寄主植物抗病基因、病原菌致病基因、寄主抗病机制等方面取得的主要进展,并试图侧重分析概括抗病反应的一般过程及毒素的作用与基因工程策略。
1 抗病相关基因根据基因的作用性质,可把抗病反应过程中起作用的基因分为两类:抗病基因和防卫反应基因。
抗病基因是决定寄主植物对病原菌的专化性识别,并激发抗病反应的基因。
即按F lo r的基因对基因理论,它与病原菌的无毒基因互补;按Keen(1990)提出的用来解释基因对基因理论分子机制的配体2受体模型〔6〕,它的产物是抗病反应信号传导链的起始组分,即信息链的前端,当它与病原菌的无毒基因直接或间接编码产物互补结合后,启动信号传导激发植物的抗病反应。
防卫反应基因是一类在抗病机制中最终起作用的基因,它们的编码产物直接或间接地作用于病原。
除此之外,抗病基因和防卫反应基因的区别还有:(1)抗病基因编码产物具有特异性,而防卫反应基因编码产物具有普遍性,即不同的寄主植物中有一套类似的防卫反应基因,如植保素合成链中的酶基因、病程相关(PR)蛋白基因、植物细胞壁成分合成酶基因等。
(2)抗病基因产物是植物防卫反应基因表达的直接或间接调节因子。
防卫反应基因一般是受病原菌诱导表达的,编码产物比较容易分离的一类基因,而抗病基因是组成型表达的,编码产物不容易分离的一类基因。
因此在基因克隆、基因编码产物的结构和功能分析等方面的研究工作中,防卫反应基因均早于抗病基因。
所以植物防卫基因既有普遍性,又有特殊性。
除有一部分是相似的外,还有一部分是不同的,如对真菌、细菌毒素的解毒基因,因毒素不同而不同。
而人工赋予植物的解毒基因则可能更加不同,有动物源的,也有微生物源的。
1.1 抗病基因接收病原菌信号,启动植物抗病反应信号转导的是植物抗病基因的编码产物,这是分子植物病理学研究寄主植物的重点和难点。
自1992年应用转座子标签法分离出第一个抗病基 收稿日期 1999207215因H m 1〔7〕,1993年应用作图克隆法分离出第二个抗病基因P to 后〔8〕,现已至少分离出16个抗病基因(R 基因)〔9,10〕。
这些基因的克隆为人们从分子水平上揭示植物抗病的内在机理以及植物的信号传递机制,并通过基因工程利用R 基因快速培育新的抗病作物品种奠定了基础。
尽管R 基因之间的序列同源性很低,但是这些R 基因编码的蛋白也具有一些相似的结构特征〔9,10〕。
根据这些结构特点,已经克隆的R 基因可以分为5个大类:ST K ,L RR 2TM ,NB S 2L RR ,L RR 2TM 2ST K 和Hm 1〔10〕。
(1)ST K 类R 基因如番茄P to 基因,其产物是一个没有L RR 结构域,位于细胞质内的典型的丝氨酸2苏氨酸激酶(Ser 2T h r k inase ),通过丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化来传递信号。
目前已经有证据表明P to 蛋白能与相应无毒基因av rP to 的产物相互作用。
(2)L RR 2TM 类R 基因的基因产物为锚定于细胞膜上的糖蛋白受体,包括三个区域:L RR 结构域,跨膜区域(tran s m em b rane dom ain ,TM )和很短的胞内区域(仅有数十个氨基酸残基)。
信号肽决定了它是胞外输出的。
(3)NB S 2L RR 类R 基因的共同特点是:在它们编码蛋白的近N 端处存在着核苷酸结合位点(nucleo tide b inding site ,NB S )。
而在它们的近C 端则存在着富含亮氨酸的重复序列(leucine 2rich rep eat ,L RR )。
L RR 是蛋白与蛋白相互作用的一种典型结构,它是由十多个Β折叠2环2Α螺旋基本单位串联形成的空间构型,呈蹄铁(ho rse shoe )状的结构。
这些膜受体的L RR 结构伸展于细胞外,蹄铁状结构的凹陷处便是结合多样性配体的部位。
(4)L RR 2TM 2ST K 类R 基因,如水稻抗白叶枯病基因X a21编码的蛋白是一类受体蛋白激酶,它的产物含有ST K 和L RR 2TM 两类R 基因的结构特点。
(5)H m 1类R 基因为玉米抗HC 2毒素基因H m 1。
玉米圆斑病菌C .ca rbonum 1号小种产生HC 2毒素,它是一个环状的四肽。
当玉米在位点H m 1隐性纯合时,该四肽是有毒致命的。
研究发现显性的H m 1编码HC 2毒素还原酶(HCTR ),它依赖于NAD PH 。
虽然H m 1被认为是第一个被克隆的小种专化性抗病基因,但它不是真正的基因对基因意义上的抗病基因,因为它的抗病作用并没有一系列的信号传导,HC 2毒素合成也不止一个基因〔11〕。
这个基因的克隆不仅对玉米圆斑病的防治具有重大意义,而且对植物抗病基因研究,尤其抗毒素研究具有重大意义。
5大类R 基因中的前四类基因的结构和功能见如下示意:59增刊刘胜毅等:植物与病原菌互作和抗病性的分子机制1.2 防卫反应基因防卫反应基因是一类在抗病机制中最终起作用的基因,受病原等分子的诱导,它们的编码产物直接或间接地作用于病原。
寄主对病原的防卫反应的诱导见如下示意:不同的植物其防卫基因可能大同小异,抗、感病品种之间的差别可能在于一套防卫基因的表达时间和表达量的差别。
因此,这类基因的研究重点可能在基因的表达调控。
当然,表达调控的研究首先必须分离、克隆这些基因。
一些已克隆的防卫反应基因按功能可分为3类。
(1)抑菌活性物质:包括:A 、抗病小分子物质生成及相关酶类:①活性氧、脂过氧化、毒性不饱和脂肪酸生成、植保素生成及相关酶类。
②糖苷酶和毒性苷元释放。
③过氧化物酶、多酚氧化酶和酚类物质氧化。
B 、抗病相关蛋白:①5类PR 蛋白,PR 2l 、PR 22、PR 23、PR 24或PR 25。
其中有降解病原菌细胞壁的酶类,如几丁酶、Β21,32葡聚糖酶;有抑制病原菌生长的酶类,如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、脂氧化酶等。
大多数PR 蛋白的功能未知。
②小分子物质,如硫堇th i on in 等。
(2)结构性变化及相关的酶:①胞壁羟脯氨酸(H PGR P )及甘氨酸糖蛋(GR P )的生成与凝聚。
②胞壁木质化及相关酶。
③伤口栓质化及相关酶。
④胞壁胼胝体生成。
⑤导管中侵填体(tylo se )的形成等。
(3)致病因子解除的酶或小分子化合物:①抑制病原果胶酶、蛋白酶的抑制剂。
②病原毒素脱毒酶。
每一类基因都已从不同植物及其它物种中分离、克隆出一批。
抗病水平高低不仅要看这些基因的表达时间和水平,还要看这些基因的累加效应。
2 病原菌致病相关基因病原菌致病相关基因是病原菌在与寄主植物互作过程中,决定其对寄主植物致病性的基因。
它决定着病原菌在侵染寄主植物过程中与植物建立寄生关系,破坏寄主细胞正常的生理代谢功能,以及调控对植物的吸附、侵染、定殖、扩展和最终显症等过程。
根据致病相关基因编码产物的功能,致病相关基因可分为:毒性基因、无毒基因和决定寄主范围的基因。
毒性基因是决定病原菌对植物基本亲和性的基因,根据对其产物的认识程度划分为已知产物的毒性基因和未知产物的毒性基因两大类。
再根据毒性基因功能的一些重要表型,又可将未知产物的毒性基因分为过敏反应和致病基因(h rp )、病害专化致病基因(dsp )等一些类型。
对致病相关基因的认识和抗病基因一样,对于阐述植物抗病机制,有效地利用抗病性有着重要的作用。
从70年代明确了引起肿瘤的根瘤农杆菌毒性因子是T 2DNA ,并发现了T i 质粒引起69中 国 农 业 科 学32卷T 2DNA 切离、转化和整合的毒性基因区(V ir 区)开始,致病基因的分离和鉴定,产物的结构和功能及表达调控已扩展到其他病原细菌、真菌、病毒及线虫等。
继L indgren (1984)等首先发现毒性基因H rp (hyp ersen sitive respon se and p athogen icity )表型〔12〕,Boucher (1985)提出了毒性基因的D sp (disease sp ecific p athogen icity )表型〔13〕,Staskaw icz (1984)等分离出第一个病原菌无毒基因avrA 〔14〕以后,目前从植物病原菌中克隆的致病基因有150个以上,仅从细菌中克隆的无毒基因就超过40个。
当前,病原菌致病相关基因的相互关系和表达调控是新的研究热点。
目前无毒基因、毒性基因中的h rp 基因等已有大量的综述文献,本文主要综述已知产物毒性基因中胞外水解酶类和毒素合成酶基因。
在病菌致病过程中这类基因指导合成的化合物被称为毒性决定因子(viru lence determ inan ts )。
胞外水解酶类是病原菌分泌的,在侵染过程中降解植物细胞壁成分的酶类,如果胶酶(PG )、纤维素酶、蛋白酶等。
从丝状真菌中克隆的果胶酶及其它水解酶基因见表。
已克隆的真菌PG 基因均为1100～1350bp ,大多含1～5内元,但核盘菌PG 基因无内元〔15〕。
不同真菌PG 基因的DNA 序列同源性很低〔16〕。
不同真菌PG 基因的氨基酸序列同源性一般在60%～65%,而同细菌和植物的同源性仅为20%。
研究表明,一个组氨酸残基和一个羧基群是PG 活性所必须的,组氨酸残基及其侧翼的丝氨酸和酰氨酸残基的氨基酸序列是高度保守的〔17〕。
据DNA 序列,所有PG 蛋白质都含有一个长20～40氨基酸的信号肽,总的分子量为33～38ku 。
其它果胶酶基因在真菌种间的变化和PG 基因相似。
尽管果胶酶的初级结构同源性差,但它们的同工酶四级结构相似性高。
如A .n iger 的PG II 抗体与核盘菌等多种真菌的PG 蛋白有交叉反应〔18〕。
然而,即使利用现代分子遗传技术,也还是难于弄清细胞壁降解酶在病原菌致病或致病力上的作用。