植物相关细菌群体感应信号分子的检测*刘晓光1, 2, 高克祥2, 高吉刚31江苏大学生命科学研究院镇江（212013）2山东农业大学植保学院泰安（271018）3 山东农业大学化学与材料科学学院泰安（271018)E-mail：xgliu66@摘要：许多革蓝氏阴性细菌以种群密度依赖的方式调控基因的表达，这种称为群体感应的调控机制主要基于细菌产生的可扩散的小分子信号物质——酰基高丝氨酸内酯（AHLs）。
通过组合使用灵敏度不同的系列报告菌株，基于琼脂平板的生物检测及反相C18薄层层析（TLC）分析，比较研究了3株植物固氮内生菌Herbaspirillum spp.和2株植物根际促生菌Serratia plymuthica产生AHLs的模式。
结果显示了植物细菌AHLs的多样性。
3株固氮内生菌Herbaspirillum spp.和S. plymuthica菌株IC1270都与小麦根际生防细菌Pseudomonas fluorescens 2-79具有相似的模式，产生OH-取代基的AHLs。
而2个S. plymuthica 菌株，从葡萄根际分离的IC1270和从油菜根际分离的菌株HRO-C48则产生完全不同类型的AHLs。
菌株IC1270主要产生OH-取代基的HHHL，HOHL， HRO-C48却产生无取代基的BHL , HHL 和优势种O-取代基的OHHL。
由此说明不同属的植物细菌可能具有相似的AHLs模式；相反，即使生态位相似的同种植物根际细菌S. plymuthica的不同菌株间，却可能产生完全不同类型的AHLs，似乎与亲缘关系无关。
关键词：Serratia plymuthica；Herbaspirillum spp.; 群体感应系统；酰基高丝氨酸内酯中图分类号：Q9331.引言在革蓝氏阴性细菌中，有3个重要的基因表达的全局调控系统，即GacA/GacS双因子信号转导系统（GacA/GacS two-component system），胁迫和稳定期的δ因子RpoS，以及细胞种群密度依赖的Quorum-sensing（QS）系统。
它们控制植物相关细菌的许多表型，如植物生长促进能力、致病性、次生代谢物的产生、生物膜形成以及蛋白和酶的分泌等[1]。
酰基高丝氨酸内脂N-acyl homoserine lactones（AHLs/acyl-HSLs）是许多革兰氏阴性细菌都产生的群体感应信号分子，它作为自身诱导物（autoinducer）在革蓝氏阴性细菌中介导以种群密度依赖和生长发育阶段(指数生长后期和稳定期)依赖方式的基因表达调控。
植物相关细菌的QS系统调控微生物种群之间以及与寄主植物之间的相互作用，包括共生、致病性、抗生素及胞外酶的产生等特性，因此在农业、医学、环境保护等领域具有广阔的应用前景。
而且AHLs在自然界中作为全局调控的信号分子，通常是在GacA/GacS两组分信号转导系统的控制之下。
许多研究已证实这3个全局调控系统之间存在着密切联系，交互作用（cross-talk）。
尽管有些结果相互矛盾，依然可以推测这种调控的级联反应在细菌中可能是一个普遍的现象[2, 3]。
本文通过组合使用多种系列灵敏度不同的AHLs信号分子的报告菌株或质粒，以植物根基金项目：本课题受国家自然科学基金（项目编号：30370954，30670030）资助际生防细菌Serratia plymuthica 菌株IC1270[4]和HRO-C48[5]，以及3种具有固氮作用的禾本科植物内生细菌Herbaspirillum spp.[6-9]为供试菌株，初步研究并比较分析了不同类型的植物相关细菌产生AHLs信号分子的模式，为进一步阐明QS系统全局调控细菌和寄主植物互作的机制奠定基础，可为通过遗传操纵QS信号通路改善植物与生防或固氮细菌菌株的有益互作开辟新途径。
2.材料和方法2.1 材料2.1.1 菌株和培养条件本研究所使用的细菌菌株和质粒见表1。
液体或固体的LB/LA (Luria-Bertani broth and agar) 用于细菌的培养。
报告菌株和供试菌株分别于30℃或37℃振荡培养（140 rpm）至对数生长后期。
2.1.2抗生素本实验所用抗生素的工作浓度：氨苄青霉素(Amp)， 100µg/ml；利福平(Rif)，40µg/ml ；庆大霉素(Gm)，30µg/ml；四环素(Tc)，20µg/ml。
购于Sigma公司。
表1 供试菌株和质粒Tab1. Strains and plasmids used in this studyStrain or plamid Relevant characteristics* Reference or sourceAgrobacterium tumefaciens NTL4/pZLR4 Gm r Cb r; β-galactosidase induction-based acyl-HSL bioreporter 11 Chromobacterium violaceum CV026 Violacein production-based acyl-HSL bioreporter 12 Escherichia coli F-endA1 hsdR17 (rK _ mK +) supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1DH5αΦ80d lacZ∆M15 λ- 13S17-1(λ-pir) thi pro hsdR hsdM recA rpsL RP4-2 (Tc r::Mu) (Km r::Tn7) 13 Pseudomonas fluorescens 2-79 phenazine+ production of 3-hydroxy acyl-HSLs 14 Serratia plymuthicaIC1270 Rif r, isolated from rhizosphere of grape in Uzbekistan 4 HRO-C48 Rif r, isolated from rhizosphere of oil rape in Germany 5 Herbaspirillum seropedicae 7 Herbaspirillum frisingense 8 Herbaspirillum rubrisubalbicans 9 PlasmidspSB401 Tc r, lux-based acyl-HSL bioreporter 15 pSB536 Amp r, lux-based acyl-HSL bioreporter 15 pSB1075 Amp r, lux-based acyl-HSL bioreporter 15* Amp r, ampicillin resistance; Gm r, gentamicin resistance; Tc r, tetracycline resistance; Rif r, rifampicin resistance.2.2 方法2.2.1 培养上清液中萃取AHLs信号分子：50 ml待测菌株的过夜培养物，通过离心除去细菌菌体，上清液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，加入无水硫酸钠，过滤后通过旋转蒸发干燥, 回溶于1.5ml乙酸乙酯中。
进一步通过真空旋转蒸发浓缩，最终残余物溶解于50µl 乙腈中，于-20℃冰箱中保存，用于基于琼脂平板的生物检测和TLC分析。
2.2.2 基于琼脂平板的AHLs生物检测：不同的报告质粒或菌株对检测不同类型取代基以及碳链长度的AHLs 信号分子的灵敏度不同[2]，本实验组合使用以下系列的报告质粒和菌株几乎可检测所有侧链长度和不同取代基的AHLs 信号分子。
参照文献[10]的方法，在已制备好的琼脂平板上，铺一层与不同报告菌株混合的0.6%的软琼脂，凝固后打孔（5mm ），孔内注入待测样品，并以合成的多种AHLs 标准样品（Sigma ）为对照。
30℃恒温箱中孵育数小时或过夜培养，观察结果并拍摄照片。
应用报告质粒（pSB401, pSB536, pSB1075）分析检测上述AHLs 提取物的生物发光（lux -based ）能力，发射的光线通过CL-BIS 发光仪 (DNR Imaging Systems Ltd.)监测。
报告菌株Chromobacterium violaceum CV026产紫色素分析由样品孔周围细菌菌苔产生的深篮紫色的色素指示AHLs 信号分子的产生；报告菌株Agrobacterium tumefaciens NTL4/pZLR4在X-Gal (40µg/ml) 存在时诱导β-半乳糖苷酶的产色分析参考文献[7]的方法，样品孔周围扩散的蓝色区带指示AHLs 信号分子的产生。
2.2.3 AHLs 信号分子的TLC 分析[11]：通常取5µl 的乙酸乙酯提取液点样于RP18，F 254S 反相TLC 平板（德国Merck ），展开剂为甲醇：水（60：40，vol/vol ）。
约4h 充分展开后，溶剂被蒸发，干燥的TLC 平板用混有不同报告菌株的软琼脂（0.6% agar ）覆盖。
琼脂凝固后，至于密闭的塑料容器中30℃恒温箱中孵育数小时或过夜培养，观察结果并拍摄照片。
以合成的AHLs 标样作对照。
3. 结果与分析3.1 S . plymuthica IC1270 和Herbaspirillum spp. 菌株AHLs 的检测分析3.1.1琼脂平板检测结果：使用产生蓝色斑点的报告菌株A. tumefaciens NTL4/pZLR4（图1A ）和生物发光的报告质粒pSB401（图1B ）时，菌株IC1270都表现阳性反应；而产紫色素的报告菌株Chromobacterium violaceum CV026和报告质粒pSB536, pSB1075都不能检测到菌株IC1270 AHLs 信号分子的产生，表现阴性反应。
也说明菌株IC1270不产生长链的信号分子（≥C 10-HSLs ）和短链的BHL(N-butanoyl-L-HSL)。
而使用报告菌株 A. tumefaciens NTL4/pZLR4时，3个Herbaspirillum spp. 菌株样品孔周围都产生蓝色区带，表现阳性反应（图1A ），产生AHLs 。
图１ 在琼脂平板上检测S. plymuthica IC1270 和Herbaspirillum spp.产生的AHLs 信号分子Fig 1 Detection of AHLs produced by S. plymuthica IC1270 and Herbaspirillum spp. on agar-plates with A.tumefaciens NTL4/pZLR4 reporter (A) and pSB401 lux reporter (B)OHHL: standard; IC1270: S. plymuthica IC1270; H1: H.seropedicae ; H2: H. frisingense ; H3: H. rubrisubalbicans3．1．2 AHLs 信号分子的TLC 分析：经TLC 分离后，使用混有报告菌株A. tumefaciens NTL4/pZLR4和x-gal 的软琼脂铺平板，与标准样品比较，并以生防菌P. fluorescens 2-79的AHLs （Lane 6）为参照[14]，结果显示S. plymuthica 菌株IC1270产生至少3种可检测水平的羟基取代基的HHHL(N-3-hydroxy-hexanoyl-L-HSL)和HOHL(N-3-hydroxy-octanoyl-L-HSL)及1种未知的信号分子； 而3个Herbaspirillum spp. 菌株产生2种可检测水平的羟基取代基的HHHL （R f =0.56）和HOHL( R f =0.30)。